【摘要】：如今,隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展,將級聯(lián)酶系統(tǒng)整合進(jìn)入能夠自主復(fù)制的微生物中以形成微生物工廠的概念,為生物合成多種化合物提供了廣泛的新方法以及創(chuàng)新性的平臺。然而異源代謝通路在原核底盤微生物中的細(xì)胞內(nèi)酶共聚化效應(yīng)通常受到限制,這會導(dǎo)致酶和底物在區(qū)域化范圍內(nèi)的濃度較低,進(jìn)而可能會限制代謝通路的生產(chǎn)效率。因此,多項研究均將目標(biāo)集中在重新排布細(xì)胞內(nèi)分子與分子間的相互作用以達(dá)到異源通路代謝酶的共聚化,增強合成的代謝通路效應(yīng)。這種共聚化的方法被稱之為人工合成支架系統(tǒng),是一種重要的代謝流路控制和代謝通路增強的方法。另外,甲羥戊酸(Mevalonate,MEV)途徑是在真核生物、古細(xì)菌和部分真細(xì)菌中存在的多種類異戊二烯化合物的主要合成途徑,其中中間代謝產(chǎn)物甲羥戊酸合成過程是關(guān)鍵限速步驟。類異戊二烯在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)在醫(yī)藥、能源、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值,然而其天然產(chǎn)物來源不足,而原核細(xì)胞異源合成方式也存在代謝酶系缺乏有效聚集機制,影響了其對中間產(chǎn)物毒性的控制和產(chǎn)量的提升。本課題中,我們在大腸桿菌中為人工合成的三酶代謝途徑,構(gòu)建了一種基于DNA的支架系統(tǒng)。這種支架系統(tǒng)引起的三酶共聚化效應(yīng),首先通過三個割裂片段的綠色熒光蛋白(split-GFP)系統(tǒng)得到證實。將三個部分的割裂綠色熒光蛋白片段(G1～9,G10和G11)分別與類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物TALE1,TALE2和TALE3蛋白結(jié)合形成融合蛋白,隨后這種設(shè)想的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與DNA適當(dāng)結(jié)合并完成完整綠色熒光蛋白的重建。當(dāng)割裂的綠色熒光蛋白重新獲得蛋白質(zhì)活性發(fā)出熒光時,此時它們在空間上以極近的距離聚集成簇,相比于不使用支架的對照組,熒光強度的增強歸因于支架系統(tǒng)的共聚化效應(yīng)。而通過共聚化外源甲羥戊酸合成通路中的三個代謝通路酶:乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶(AtoB)、三羥基三甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)、三羥基三甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶(HMGR)驗證了這種通路增強效應(yīng)在三酶代謝途徑中的應(yīng)用。以DNA質(zhì)粒作為支架,將外源的酶與合理設(shè)計的TALEs蛋白融合,我們的方法增強了與TALE融合的酶集成簇的催化活性,并成功使生產(chǎn)甲羥戊酸的三酶途徑的產(chǎn)量增長大約3.7倍,與以前研究過的其他DNA支架系統(tǒng)所取得的效果相似,甚至更好。另外,我們通過篩選酶的聚集效應(yīng)和甲羥戊酸產(chǎn)量,得到最佳支架結(jié)構(gòu)的相關(guān)參數(shù),涉及間隔距離以及結(jié)合位點順序。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了基于TALE的支架系統(tǒng)具有良好的擴(kuò)展性以及穩(wěn)定性,并且可以假設(shè),由于該支架系統(tǒng)被程序化設(shè)計的特性,能將其用于其它的多酶代謝通路。
【學(xué)位授予單位】：國防科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R378.21
【圖文】：

因為此時成本要求非常嚴(yán)格。因此，現(xiàn)有的工業(yè)化生產(chǎn)宿玄具有能夠應(yīng)用逡逑的基因工具非常關(guān)鍵，這些宿主可以在簡單的、低成本的碳源和鹽的環(huán)境中生長，逡逑或者＾￡低成本的、最小限量添加物的天然培養(yǎng)基中生長［１７，１８］。常見宿主如圖１．３逡逑所示。逡逑Ｒ棚逡逑Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ邐Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ邋ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ逡逑圖１．３大腸桿菌和釀酒酵母逡逑１．１．３．１外源基因?qū)牒痛x平衡逡逑問題的關(guān)鍵在于，需要遺傳學(xué)工具將編碼代謝通路的外源基囡和控制它們的逡逑表達(dá)以達(dá)到最大產(chǎn)f埡托Ъ鄣耐庠椿虻既胨拗鰲Ｔ詿還こ談腦斕南赴校忮義閑┍嗦胱傅幕蠆恍枰罅勘澩錚匭氡澩鋝齙揭歡ǖ拇呋潦�，足辶x瞎皇實鋇刈恢屑洳鍔傷璧牟錚锏醬呋ズ退健９龤俚乇澩鎪義閑璧幕蚪峁嗟羋傭嵯赴拇晃錚跋熳鈧詹锏暮銑�，否则諒T┐晃镥義顯蚩梢雜糜謁枘勘瓴锏納乇鴝砸恍┳畹拖薅攘炕鎦實納淺Ｖ劐義弦�，葰g捅澩锘蛟蚧嵩斐紗煌菲烤薄４送�，还噻U庠創(chuàng)煌分械膩義洗恢屑湮錕贍芏砸煸此拗饔卸拘

本文編號：2713701