【摘要】：目的:初步探討人工合成多肽MAC-1(以下簡稱MAC-1)體外和體內(nèi)抗乙型肝炎病毒作用及機制。方法:1、以轉(zhuǎn)染人HBV全基因組的人肝癌細胞(HepG2.2.15)為體外細胞模型。(1)MAC-1對HepG2.2.15細胞的活性作用,不同濃度MAC-1(10,100,1000,2000,10000μg/ml)作用細胞48h,采用MTT方法檢測細胞活性;(2)MAC-1抗HBV活性作用,根據(jù)不同組別:連續(xù)用藥對照組(Control L),間斷用藥對照組(Control J),低、中、高(10,50,100μg/ml)三個MAC-1濃度組,恩替卡韋連續(xù)用藥組(3.75nmol/L ETV L),恩替卡韋間斷用藥組(3.75nmol/L ETV J)分別作用HepG2.2.15細胞3d、6d、9d,采用實時熒光定量核酸擴增技術(shù)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)檢測上清液HBV DNA、HBeAg和HBsAg水平。(3)MAC-1抗HBV的作用機制,根據(jù)不同劑量10,50,100μg/ml MAC-1分別作用24h,用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(reverse transcriptionreal time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測細胞內(nèi)3.5kb RNA、HNF1α、HNF4α的基因相對表達水平;采用Western Blot檢測細胞內(nèi)pERK,tERK,HNF1α,HNF4α的蛋白相對表達水平。2、以感染的雛鴨構(gòu)建鴨乙型肝炎病毒(DHBV)動物模型。(1)感染雛鴨隨機分為高濃度MAC-1組(40mg/ml/kg),低濃度MAC-1組(20mg/ml/kg),病毒對照組(生理鹽水),恩替卡韋對照組(0.1mg/kg);未感染雛鴨隨機分成2組:MAC-1對照組(40mg/ml/kg),陰性對照組(生理鹽水)各組采用腹腔注射的方法處理10天,分別在雛鴨用藥前(D0),用藥第五天(D5),用藥第十天(D10),停藥第三天(P3)四個時間點頸靜脈采血并稱量體重,采用ELISA方法檢測各時間點血清中DHBsAg、DHBeAg的水平,采用qPCR方法檢測血清中DHBV DNA病毒的含量,采用組織病理切片法觀察雛鴨肝臟組織的病理變化。結(jié)果:1、MAC-1體外對乙型肝炎病毒的影響及其作用機制研究。(1)MAC-1對HepG2.2.15細胞存活率影響:MAC-1小于1000μg/ml濃度下,對細胞沒有明顯毒性作用(P0.05);(2)MAC-1對HepG2.2.15細胞上清液中HBV的影響:三個濃度MAC-1與Control J比較,均作用使細胞上清液HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表達減少(P0.05);(3)MAC-1對HBV作用的機制,各劑量MAC-1組與Control J組比較,3.5kb RNA及肝細胞內(nèi)HNF1α、HNF4αmRNA表達均沒有顯著差異(P0.05),t-ERK和p-ERK信號蛋白和HNF1α蛋白沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),HNF4α蛋白表達出現(xiàn)顯著下調(diào),隨著MAC-1濃度增加下調(diào)越明顯(P0.05)。2、以感染DHBV雛鴨為動物模型。(1)MAC-1對雛鴨血清DHBV復(fù)制:低和高濃度MAC-1組分別在T0、T5、T10和P3天,干預(yù)前后其DHBV DNA濃度無顯著差異(P0.05),與病毒組比較DHBV DNA、HBsAg、HBeAg水平無明顯差異(P0.05);(2)MAC-1對雛鴨體重與肝脾指數(shù)的影響:隨著時間的延長,雛鴨體重逐漸增加,各組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),雛鴨肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)各組間比較均無差異(P0.05);(3)MAC-1對雛鴨肝臟組織病理的影響:病毒組炎細胞浸潤病變較重,部分淤血等病理改變,MAC-1組炎細胞浸潤與病毒組比較有減輕病理變化。結(jié)論:1、MAC-1可抑制HepG2.2.15細胞系上清液HBV DNA、HBsAg、HBeAg的水平;2、MAC-1抑制HBV復(fù)制可能通過下調(diào)HNF4α表達,但可能不是通過激活ERK1/2信號通路;3、MAC-1對雛鴨體內(nèi)DHBV DNA和DHBsAg、DHBeAg表達無明顯抑制作用;4、MAC-1一定濃度范圍內(nèi)可能具有改善HBV引起肝臟炎性病變的作用。
【圖文】：

Marker 朝左放入多功能凝膠成像系統(tǒng)中曝光。1.2.5 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（ ±s）表示，組間比較用 one-wayANOVA 方法進行分析。方差齊性時，采用 LSD 方法進行組間多重比較。用統(tǒng)計軟件 SPSS 22.0 進行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)義。2 結(jié) 果2.1 MAC-1 的鑒定MAC-1 純度及其結(jié)構(gòu)分析 高效液相色譜分析 MAC-1 多肽的純度>95%，質(zhì)譜分析分子量 3022.6Da。利用 RCSB PDB Server 和 I-TASSER On-line Server系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫對 MAC-1 的氨基酸序列進行多肽結(jié)構(gòu)預(yù)測，以 α 螺旋為主，少量 β折疊（如圖 2-1, 圖 2-2）。由于 MAC-1 多肽序列專利申請中，未展示。χ

Marker 朝左放入多功能凝膠成像系統(tǒng)中曝光。1.2.5 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（ ±s）表示，組間比較用 one-wayANOVA 方法進行分析。方差齊性時，采用 LSD 方法進行組間多重比較。用統(tǒng)計軟件 SPSS 22.0 進行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)義。2 結(jié) 果2.1 MAC-1 的鑒定MAC-1 純度及其結(jié)構(gòu)分析 高效液相色譜分析 MAC-1 多肽的純度>95%，質(zhì)譜分析分子量 3022.6Da。利用 RCSB PDB Server 和 I-TASSER On-line Server系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫對 MAC-1 的氨基酸序列進行多肽結(jié)構(gòu)預(yù)測，，以 α 螺旋為主，少量 β折疊（如圖 2-1, 圖 2-2）。由于 MAC-1 多肽序列專利申請中，未展示。χ
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R373

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本文編號：2709340