【摘要】：甲型H1N1(Influenza A virus H1N1)流感病毒是甲型流感病毒家族中的極其重要的一員,是全球大流感爆發(fā)的主要病原體,對(duì)人類的健康造成了極大的威脅,日常普通預(yù)防和抗病毒藥物均不能有效防止其對(duì)人類的感染。目前,預(yù)防甲型H1N1流感病毒的最有效方法為接種流感疫苗。流感疫苗的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝使用雞胚作為生產(chǎn)基質(zhì),存在諸多缺點(diǎn),WHO推薦使用MDCK細(xì)胞作為流感疫苗的優(yōu)良生產(chǎn)基質(zhì)。細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)制備病毒疫苗是我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路,而找到理想的細(xì)胞作為流感疫苗生產(chǎn)基質(zhì)是這一工藝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本文采用有限稀釋法制備并建立了MDCK單克隆細(xì)胞庫,篩選獲得了兩株甲型H1N1流感病毒高敏感適應(yīng)性MDCK單克隆細(xì)胞株,并對(duì)該兩株細(xì)胞的生長特性和增殖規(guī)律進(jìn)行了研究,根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)程要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢定。獲得以下主要研究結(jié)果:1.從CCTCC引進(jìn)一株貼壁培養(yǎng)MDCK細(xì)胞,利用有限稀釋法制備MDCK單克隆細(xì)胞。通過探索血清類型、血清濃度、單孔細(xì)胞密度對(duì)制備單克隆細(xì)胞的影響,摸索出理想的有限稀釋法制備參數(shù)為胎牛血清濃度為15%、單孔接種密度為1個(gè)/孔。共制備114株MDCK單克隆細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞資源基礎(chǔ)。2.復(fù)蘇MDCK單克隆細(xì)胞,細(xì)胞活率平均為0.954±0.016;92.1%的細(xì)胞3天以內(nèi)長滿;生長狀態(tài)良好的細(xì)胞有66株,占比為57.9%;共有三種細(xì)胞形態(tài),包括多角上皮樣、成纖維樣、島狀樣。采用測定血凝滴度值方法篩選出兩株甲型H1N1流感病毒高敏感適應(yīng)性細(xì)胞株MDCK CL118和MDCK CL134,其血凝滴度值達(dá)到1:128,MDCK單克隆細(xì)胞的工作庫為1:32。MDCK CL118、MDCK CL134和MDCK工作庫細(xì)胞的TCID_(50)值分別為7.23 log_(10)TCID_(50)/mL、7.4 log_(10)TCID_(50)/mL、6.33log_(10)TCID_(50)/mL。MDCK單克隆細(xì)胞經(jīng)過20次傳代后保持較高較穩(wěn)定血凝滴度。3.建立主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫,根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)程進(jìn)行檢定。形態(tài)與官網(wǎng)上一致,單克隆細(xì)胞株MDCK CL118和MDCK CL134的復(fù)蘇活率分別為95.44%和94.95%;密度分別為22.3×10~4/mL和23.5×10~4/mL;最大增值濃度分別為66.6×10~4/mL和38.4×10~4/mL;倍增時(shí)間分別為18.7h和23.17h,生長曲線均呈“S”型。染色體數(shù)目2n=74-76分別有30張和31張,占比分別為58%和62%。乳酸脫氫酶同工酶實(shí)驗(yàn),MDCK CL118、MDCK CL134、MDCK母細(xì)胞的條帶數(shù)目均為3條,遷移距離完全一致,兩株細(xì)胞和MDCK母細(xì)胞同種屬。無菌檢查、支原體檢查、細(xì)胞內(nèi)外源病毒因子檢查實(shí)驗(yàn),MDCK CL118和MDCK CL134單克隆細(xì)胞株均為陰性。
【圖文】：

西北民族大學(xué)生命與科學(xué)工程學(xué)院 2016 級(jí)碩士研究生畢業(yè)論文生長速度較新生牛血清快。同傳代比例生長 48 h，，胎牛血清培養(yǎng)的 MDCK 細(xì)胞匯合可以達(dá)到 95%，而新生牛血清培養(yǎng)的 MDCK 細(xì)胞匯合度只有 80%。表明胎牛血清MDCK 細(xì)胞的體外增殖過程中，可使細(xì)胞增殖更加活躍。胎牛血清培養(yǎng)的 MDCK 克隆細(xì)胞，長滿單層后均勻分布，細(xì)胞胞質(zhì)豐滿，核仁清晰。新生牛培養(yǎng)上清液較牛血清上清液渾濁，細(xì)胞上清液中細(xì)胞出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，死亡細(xì)胞增多。因此，用胎血清制備 MDCK 單克隆細(xì)胞生長狀態(tài)更好。2.2.2 血清類型對(duì) MDCK 單克隆細(xì)胞株?duì)顟B(tài)對(duì)比

A 多角上皮樣細(xì)胞(×100)；B.梭形成纖維樣細(xì)胞(×100)；C.島狀樣細(xì)胞（×100圖 3-1 MDCK 單克隆細(xì)胞的生長形態(tài)Figure 3-1 Growth morphology of MDCK monoclonal cells3.3 討論流感對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重，及時(shí)接種疫苗是預(yù)防流感最有效的方法[70]。目前，獲準(zhǔn)生產(chǎn)人用流感疫苗的細(xì)胞系主要有 Vero 細(xì)胞和 MDCK 細(xì)胞[33]。近年來使用 MDC
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 馮磊;吳培培;褚軒;王偉峰;陳麗;侯繼波;;MDCK單細(xì)胞懸浮生長的馴化篩選及其在AIV增殖上的初步應(yīng)用[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2015年06期

2 馬桂蘭;暴艷敏;徐水林;孔來信;王家敏;馬忠仁;喬自林;;胎牛血清和新生牛血清體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的效果比較[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年02期

3 劉蘇健;申慶民;吳繼東;劉宏;趙京;;兔原代胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法及不同濃度血清培養(yǎng)基對(duì)其增殖的研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志;2013年09期

4 王家敏;平玲;沈武玲;徐水林;魏園園;馬忠仁;喬自林;;MDCK細(xì)胞庫的建立及其生物學(xué)特性研究[J];山西農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年12期

5 龔迪;易小萍;張?jiān)d;;MDCK細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)放大工藝研究[J];中國生物工程雜志;2012年09期

6 馮婷;殷仲偉;李晉蓉;范營營;涂文偉;李虹;;流感病毒H1N1在MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)及純化條件的優(yōu)化[J];中國病原生物學(xué)雜志;2012年07期

7 張良艷;姚志東;邢麗;劉坤;王希良;;MDCK單克隆細(xì)胞庫的建立及檢定[J];生物技術(shù)通訊;2012年02期

8 劉超;胡春吉;徐瑞芹;;2009甲型H1N1流感病毒的研究綜述[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年27期

9 朱廣蕊;潘耀謙;夏銀可;劉興友;;甲型H1N1流感病毒致病機(jī)理研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年08期

10 何顏霞;;2009甲型H1N1流感相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[J];中國實(shí)用兒科雜志;2010年02期

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1 王石磊;基于MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗研究[D];上海交通大學(xué);2012年

2 龔迪;生物反應(yīng)器低血清微載體懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞[D];華東理工大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2707864