【摘要】：甲型H1N1(Influenza A virus H1N1)流感病毒是甲型流感病毒家族中的極其重要的一員,是全球大流感爆發(fā)的主要病原體,對人類的健康造成了極大的威脅,日常普通預(yù)防和抗病毒藥物均不能有效防止其對人類的感染。目前,預(yù)防甲型H1N1流感病毒的最有效方法為接種流感疫苗。流感疫苗的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝使用雞胚作為生產(chǎn)基質(zhì),存在諸多缺點,WHO推薦使用MDCK細胞作為流感疫苗的優(yōu)良生產(chǎn)基質(zhì)。細胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)制備病毒疫苗是我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路,而找到理想的細胞作為流感疫苗生產(chǎn)基質(zhì)是這一工藝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本文采用有限稀釋法制備并建立了MDCK單克隆細胞庫,篩選獲得了兩株甲型H1N1流感病毒高敏感適應(yīng)性MDCK單克隆細胞株,并對該兩株細胞的生長特性和增殖規(guī)律進行了研究,根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)程要求對細胞進行檢定。獲得以下主要研究結(jié)果:1.從CCTCC引進一株貼壁培養(yǎng)MDCK細胞,利用有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞。通過探索血清類型、血清濃度、單孔細胞密度對制備單克隆細胞的影響,摸索出理想的有限稀釋法制備參數(shù)為胎牛血清濃度為15%、單孔接種密度為1個/孔。共制備114株MDCK單克隆細胞,為后續(xù)實驗提供細胞資源基礎(chǔ)。2.復(fù)蘇MDCK單克隆細胞,細胞活率平均為0.954±0.016;92.1%的細胞3天以內(nèi)長滿;生長狀態(tài)良好的細胞有66株,占比為57.9%;共有三種細胞形態(tài),包括多角上皮樣、成纖維樣、島狀樣。采用測定血凝滴度值方法篩選出兩株甲型H1N1流感病毒高敏感適應(yīng)性細胞株MDCK CL118和MDCK CL134,其血凝滴度值達到1:128,MDCK單克隆細胞的工作庫為1:32。MDCK CL118、MDCK CL134和MDCK工作庫細胞的TCID_(50)值分別為7.23 log_(10)TCID_(50)/mL、7.4 log_(10)TCID_(50)/mL、6.33log_(10)TCID_(50)/mL。MDCK單克隆細胞經(jīng)過20次傳代后保持較高較穩(wěn)定血凝滴度。3.建立主細胞庫和工作細胞庫,根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)程進行檢定。形態(tài)與官網(wǎng)上一致,單克隆細胞株MDCK CL118和MDCK CL134的復(fù)蘇活率分別為95.44%和94.95%;密度分別為22.3×10~4/mL和23.5×10~4/mL;最大增值濃度分別為66.6×10~4/mL和38.4×10~4/mL;倍增時間分別為18.7h和23.17h,生長曲線均呈“S”型。染色體數(shù)目2n=74-76分別有30張和31張,占比分別為58%和62%。乳酸脫氫酶同工酶實驗,MDCK CL118、MDCK CL134、MDCK母細胞的條帶數(shù)目均為3條,遷移距離完全一致,兩株細胞和MDCK母細胞同種屬。無菌檢查、支原體檢查、細胞內(nèi)外源病毒因子檢查實驗,MDCK CL118和MDCK CL134單克隆細胞株均為陰性。
【圖文】：

西北民族大學(xué)生命與科學(xué)工程學(xué)院 2016 級碩士研究生畢業(yè)論文生長速度較新生牛血清快。同傳代比例生長 48 h，，胎牛血清培養(yǎng)的 MDCK 細胞匯合可以達到 95%，而新生牛血清培養(yǎng)的 MDCK 細胞匯合度只有 80%。表明胎牛血清MDCK 細胞的體外增殖過程中，可使細胞增殖更加活躍。胎牛血清培養(yǎng)的 MDCK 克隆細胞，長滿單層后均勻分布，細胞胞質(zhì)豐滿，核仁清晰。新生牛培養(yǎng)上清液較牛血清上清液渾濁，細胞上清液中細胞出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，死亡細胞增多。因此，用胎血清制備 MDCK 單克隆細胞生長狀態(tài)更好。2.2.2 血清類型對 MDCK 單克隆細胞株狀態(tài)對比

A 多角上皮樣細胞(×100)；B.梭形成纖維樣細胞(×100)；C.島狀樣細胞（×100圖 3-1 MDCK 單克隆細胞的生長形態(tài)Figure 3-1 Growth morphology of MDCK monoclonal cells3.3 討論流感對人類健康威脅嚴重，及時接種疫苗是預(yù)防流感最有效的方法[70]。目前，獲準生產(chǎn)人用流感疫苗的細胞系主要有 Vero 細胞和 MDCK 細胞[33]。近年來使用 MDC
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2707864