【摘要】：肺炎鏈球菌是一種常見(jiàn)的呼吸道病原體,主要定植于鼻咽處的呼吸道粘膜中。據(jù)統(tǒng)計(jì),每年有幾百萬(wàn)人死于肺炎鏈球菌感染,嬰幼兒和老年人所占比例較高。雖然莢膜多糖疫苗和莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng),但因血清型限制,導(dǎo)致其保護(hù)性有限且容易引起血清型替代現(xiàn)象。肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)是一種存在于所有肺炎鏈球菌中的具有高免疫原性的表面蛋白,分為3個(gè)家族和6個(gè)亞類(lèi),可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的免疫反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,我們構(gòu)建了一種PspA蛋白聯(lián)合疫苗PspAs,它包括PsaA-PspA23蛋白和PspA4蛋白,相比于Ppv23疫苗,其產(chǎn)生了較好的免疫原性及免疫保護(hù)性。然而,PspAs疫苗對(duì)一些菌株沒(méi)有很好的保護(hù)能力。本研究的目的是通過(guò)篩選并加入有效的佐劑以提高PspAs疫苗的有效性。我們選擇四種佐劑(氫氧化鋁、MF59、AS03、AS02)與PspAs蛋白進(jìn)行聯(lián)合免疫,并進(jìn)行佐劑劑量?jī)?yōu)化和免疫評(píng)價(jià),測(cè)定了小鼠抗體效價(jià)、抗體IgG分型、血肺菌載量、存活率和細(xì)胞因子水平。結(jié)果表明,所有疫苗在抗原特異性免疫球蛋白G(IgG)效價(jià)方面均顯示出佐劑劑量依賴(lài)性的改善,同時(shí),用PspAs蛋白與各種佐劑聯(lián)合免疫的小鼠菌肺及菌血載量明顯減少。而在這些聯(lián)合免疫疫苗中,AS02佐劑PspAs疫苗誘導(dǎo)的IgG效價(jià)高于其他佐劑,且對(duì)不同家族、不同亞類(lèi)的病原菌具有較好的保護(hù)作用。此外,只有AS02組顯示了高水平的細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4。這些結(jié)果表明,AS02與PspAs蛋白聯(lián)合應(yīng)用有望成為下一代肺炎疫苗。調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行У脑u(píng)價(jià)莢膜多糖疫苗的有效性。但肺炎蛋白疫苗卻缺少有效的體外評(píng)價(jià)方法。本論文評(píng)價(jià)了被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)、調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)和補(bǔ)體抑制實(shí)驗(yàn)三種體外方法。在被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)中,首先確定了實(shí)驗(yàn)流程,即采用兔血清腹腔注射小鼠,注射6小時(shí)后,進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。然后,利用被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)了兩株不同的肺炎鏈球菌的攻毒保護(hù)能力。結(jié)果顯示隨著血清稀釋倍數(shù)的增大,小鼠的存活率逐漸下降。在調(diào)理吞噬和補(bǔ)體抑制實(shí)驗(yàn)中,評(píng)價(jià)了4株不同的肺炎鏈球菌。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)不能準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)PspAs疫苗的有效性,與之相比,補(bǔ)體抑制實(shí)驗(yàn)更適合。但是補(bǔ)體為什么能夠在PspAs抗體存在時(shí)對(duì)肺炎鏈球菌產(chǎn)生抑制作用的機(jī)制還不清楚。為了進(jìn)一步探究PspA蛋白對(duì)補(bǔ)體抑制效果的影響,我們構(gòu)建了PspA蛋白缺陷的肺炎鏈球菌并進(jìn)行了補(bǔ)體抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,PspA蛋白缺陷的菌株與野生型菌株相比,莢膜多糖疫苗的免疫血清組的抑制效果有了明顯的提升,這表明PspA具有阻礙補(bǔ)體介導(dǎo)的菌體生長(zhǎng)抑制的作用,這一發(fā)現(xiàn)為肺炎鏈球菌PspA蛋白疫苗體外評(píng)價(jià)方法的建立提供了新的思路。
【圖文】：

肺炎鏈球菌蛋白示意圖

2.1 SDS-PAGE 鑒定蛋白 PsaA-PspA23 和表達(dá)的 PsaA-PspA23 和 PspA4 蛋白經(jīng)過(guò)純化并經(jīng)考馬斯亮藍(lán)顯色。 Lane1：真核預(yù)染 MA23 蛋白；Lane3：純化后的 PspA4 蛋白。 蛋白與氫氧化鋁佐劑的吸附率測(cè)定佐劑是目前應(yīng)用最廣泛的佐劑之一。氫氧化鋁合。因此為了探究 PspAs 蛋白與氫氧化鋁佐劑鋁佐劑對(duì) PspAs 蛋白的吸附率。在免疫時(shí)每只L，其中含有25μg PspAs蛋白（5μg PsaA-PspA氧化鋁佐劑對(duì)蛋白的吸附率時(shí)，固定蛋白的劑佐劑的劑量，從而得到氫氧化鋁佐劑對(duì) PspA個(gè)樣品的體積為 100μL，含有 25μg PspAs 蛋白
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2700151