【摘要】：弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生原生動物,屬于頂端復合體,可感染幾乎所有.的有核細胞,引起人畜共患的弓形蟲病。目前,弓形蟲病尚無有效治療藥物,迫切需要找到有效的藥物靶點,以開發(fā)治療弓形蟲的新型藥物。氨基肽酶作為一種蛋白酶在蛋白質(zhì)成熟、多肽降解和蛋白質(zhì)穩(wěn)定等方面起關(guān)鍵性作用,并作為藥物靶點已在人類和動物疾病的防治上得到了廣泛的研究,尤其是瘧原蟲病的防治已經(jīng)將這些氨基肽酶聯(lián)合作為有效的藥物靶點,而關(guān)于弓形蟲氨基肽酶的研究,非常少見。因此,本研究為氨基肽酶作為弓形蟲藥物靶點的研究提供理論依據(jù),以弓形蟲為研究對象,系統(tǒng)分析弓形蟲氨基肽酶N3(TgAPN3)的亞細胞定位和生化特性。研究結(jié)果如下:通過同源性比對顯示,TgAPN3的氨基酸序列與哈氏哈蒙德蟲酶具有高度同一性(97%),與人源氨基肽酶N的同源性較低(24%);細胞定位分析顯示TgAPN3定位于蟲體的胞漿內(nèi),與致密顆粒的標志性蛋白共定位;為了分析TgAPN3的酶活性,使用大腸桿菌對重組的弓形蟲氨基肽酶N3(rTgAPN3)進行了體外表達,純化后的蛋白對H-Ala-MCA熒光底物顯示出了明顯的酶活性;pH的變化對TgAPN3的酶活性有明顯的影響，該酶在酸性范圍內(nèi)顯示出良好的活性,在pH為7.0時顯示出了最大酶活性;不同金屬離子影響TgAPN3的酶活性,與其他金屬離子相比,Co2+離子對酶活性的增強效果最為明顯;底物偏好性鑒定結(jié)果顯示,該酶優(yōu)先選擇含有N-末端為Ala殘基的底物,其次是Tyr和Cys;酶抑制劑的鑒定結(jié)果顯示,bestatin和phebestatin顯著抑制了 rTgAPN3的酶活性。因此,TgAPN3在酸性環(huán)境及金屬離子Co2+作用下,以H--Ala-MCA作為底物時具有高活性。弓形蟲分裂期間在致密顆粒和PV中檢測到TgAPN3,表明致密顆粒蛋白成熟和分泌的潛在作用。這結(jié)果對TgAPN3的定位分析為其功能研究奠定了基礎(chǔ),而TgAPN3體外生化特性的鑒定為該酶作為弓形蟲藥物靶點的研究提供了重要的理論依據(jù)。
【圖文】：

圖１邋ＴｇＡＰＮ３的序列比對、進化樹和分子建模逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ａｎｄ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｍｏｄｅｌｉｎｇ邋ｏｆ邋ＴｇＡＰＮ３逡逑２弓形蟲ＡＰＮ３的表達逡逑如預期的那樣，，表達含有Ｎ端Ｈｉｓ標簽的ｒＴｇＡＰＮ２蛋白。通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ評估逡逑ｒＴｇＡＰＮ３的分子量為１０８ｋＤａ。逡逑ＢＳＡ邋（ｎｇ／ｕｆ）逡逑ｒＴｇＡＰＮ３邋Ｍ邋１２５邐２５０邋５００邋１０００逡逑ＫＤａ邋．．．．．．．．．．邐．一邐邐逡逑１８０邋—逡逑１３０—邐—逡逑９５一＾＾邋一逡逑７２一S茫櫻蓿紓蓿椋礤義希擔怠濉ㄥ我槐劐義希矗沖濉義蟨海浚В懼危В�、逦：Ｓz垮義希常村濉偽蝗紓義希玻跺濉誨我唬у義希蓿螅恚�？＝邋－？ｍ？：辶x

本文編號：2691068