【摘要】：細胞信號轉導往往通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的動態(tài)相互作用實現(xiàn)。一旦一個信號被終止,相互作用的信號蛋白就會及時分離,使細胞回到一個基本狀態(tài),準備對下一個刺激做出反應。這些動態(tài)蛋白質(zhì)相互作用的關鍵環(huán)節(jié)是由模塊化結構域去親和識別具有特殊序列特征的結構來完成的。酪氨酸磷酸化(Phosphorylation tyrosine,pY)作為一種特殊信號對接位點,介導著信號轉導的重要通路,與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系。目前的研究表明,人類細胞中預計存在數(shù)以萬計的酪氨酸磷酸化位點,而它們與特異性識別結構域(如SH2結構域)的作用網(wǎng)絡并不十分清楚,嚴重制約了這一領域發(fā)展。然而,由于酪氨酸磷酸化和識別蛋白的豐度往往都很低,其介導的蛋白互作結合力較弱,且常常瞬時發(fā)生,因此它們的互作分析非常具有挑戰(zhàn)。本論文,我們構建并表達了GST-SRC_(SH2)蛋白,用以模擬酪氨酸磷酸化結合蛋白反應的關鍵結構域,并以SHC1-pY~(317)為例,設計并制備了一種酪氨酸磷酸化光親和探針,用于強效而特異性地富集其靶標蛋白。我們先優(yōu)化了這類探針反應所需要的最佳體系,我們的結果表明,所開發(fā)的探針即使在復雜的環(huán)境中也能高選擇性地捕獲特異性結合的靶蛋白。根據(jù)設計的第一條光交聯(lián)親和探針,我們希望其在專一性和特異性滿足的基礎上,進一步拓展靶標蛋白的富集范圍。因此,我們在此基礎上引入組合多肽配體庫(CPLL)技術,構建了酪氨酸磷酸化的組合光親和探針庫,然后與基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術相結合,鑒定到了24個具有SH2結構域的特異性酪氨酸磷酸化結合蛋白,這與以往報道的方法相比,具有更好的富集效果。此外,我們還發(fā)現(xiàn)了一些尚未報道但對pY具有潛在結合能力的識別蛋白,借助生化手段和定量蛋白質(zhì)組學技術,以及結構分析,我們驗證了PKN2對pY的特異性識別能力。我們的實驗結果表明,該方法不僅可以表征酪氨酸磷酸化與SH2結構域的動態(tài)互作,還應可用于探索、挖掘未知的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的特異性識別蛋白。
【圖文】：

多肽探針 1（p-3）：FD-Bpa-PS-(pY)-VNVQNLK(Biotin)對反應濃度優(yōu)化,以最大強度為 100 計算光照時間的優(yōu)化圖 1.6，我們將膠圖中的條帶進行提取，通過條帶的強度確定探針的富將最高值統(tǒng)一歸一化到 100%。由此我們制作了柱狀圖，來更清晰直觀針的富集效率。通過膠圖和柱狀圖我們可以發(fā)現(xiàn)，目標產(chǎn)物的量隨著射時間的延長而明顯增加，當照射時間超過 30 分鐘時，目標產(chǎn)物的產(chǎn)著提高。因為在 365 nm 紫外的照射下，雖然探針與 GST-SRCSH2蛋白交聯(lián)反應，但是同時會因溫度的迅速升高產(chǎn)生蛋白的降解，影響富集得注意的是，與沒有紫外交聯(lián)的陰性對照相比，探針顯示目標富集率，這意味著蛋白捕捉擁有紫外依賴性。在光照接近 30 min 時，探針SRCSH2蛋白交聯(lián)效率最好。因此我們選擇 30 min 作為后續(xù)實驗的光照條

探針 1（p-3）：FD-Bpa-PS-(pY)-VNVQNLK(Biotin)光間優(yōu)化，以最大強度為 100 計算系鹽離子的濃度優(yōu)化結合緩沖液的鹽濃度對特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用究了不同的結合緩沖液對目標物富集率的影響[59]。如圖增加到 1×結合緩沖液，捕獲的目標顯著增加，，鹽濃度過果明顯下調(diào)。因此，在隨后的實驗中，我們選擇 1×結合質(zhì)。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R341

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本文編號：2690418