【摘要】：細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)往往通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)相互作用實(shí)現(xiàn)。一旦一個(gè)信號被終止,相互作用的信號蛋白就會(huì)及時(shí)分離,使細(xì)胞回到一個(gè)基本狀態(tài),準(zhǔn)備對下一個(gè)刺激做出反應(yīng)。這些動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是由模塊化結(jié)構(gòu)域去親和識別具有特殊序列特征的結(jié)構(gòu)來完成的。酪氨酸磷酸化(Phosphorylation tyrosine,pY)作為一種特殊信號對接位點(diǎn),介導(dǎo)著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路,與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系。目前的研究表明,人類細(xì)胞中預(yù)計(jì)存在數(shù)以萬計(jì)的酪氨酸磷酸化位點(diǎn),而它們與特異性識別結(jié)構(gòu)域(如SH2結(jié)構(gòu)域)的作用網(wǎng)絡(luò)并不十分清楚,嚴(yán)重制約了這一領(lǐng)域發(fā)展。然而,由于酪氨酸磷酸化和識別蛋白的豐度往往都很低,其介導(dǎo)的蛋白互作結(jié)合力較弱,且常常瞬時(shí)發(fā)生,因此它們的互作分析非常具有挑戰(zhàn)。本論文,我們構(gòu)建并表達(dá)了GST-SRC_(SH2)蛋白,用以模擬酪氨酸磷酸化結(jié)合蛋白反應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,并以SHC1-pY~(317)為例,設(shè)計(jì)并制備了一種酪氨酸磷酸化光親和探針,用于強(qiáng)效而特異性地富集其靶標(biāo)蛋白。我們先優(yōu)化了這類探針反應(yīng)所需要的最佳體系,我們的結(jié)果表明,所開發(fā)的探針即使在復(fù)雜的環(huán)境中也能高選擇性地捕獲特異性結(jié)合的靶蛋白。根據(jù)設(shè)計(jì)的第一條光交聯(lián)親和探針,我們希望其在專一性和特異性滿足的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步拓展靶標(biāo)蛋白的富集范圍。因此,我們在此基礎(chǔ)上引入組合多肽配體庫(CPLL)技術(shù),構(gòu)建了酪氨酸磷酸化的組合光親和探針庫,然后與基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合,鑒定到了24個(gè)具有SH2結(jié)構(gòu)域的特異性酪氨酸磷酸化結(jié)合蛋白,這與以往報(bào)道的方法相比,具有更好的富集效果。此外,我們還發(fā)現(xiàn)了一些尚未報(bào)道但對pY具有潛在結(jié)合能力的識別蛋白,借助生化手段和定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),以及結(jié)構(gòu)分析,我們驗(yàn)證了PKN2對pY的特異性識別能力。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法不僅可以表征酪氨酸磷酸化與SH2結(jié)構(gòu)域的動(dòng)態(tài)互作,還應(yīng)可用于探索、挖掘未知的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的特異性識別蛋白。
【圖文】：

多肽探針 1（p-3）：FD-Bpa-PS-(pY)-VNVQNLK(Biotin)對反應(yīng)濃度優(yōu)化,以最大強(qiáng)度為 100 計(jì)算光照時(shí)間的優(yōu)化圖 1.6，我們將膠圖中的條帶進(jìn)行提取，通過條帶的強(qiáng)度確定探針的富將最高值統(tǒng)一歸一化到 100%。由此我們制作了柱狀圖，來更清晰直觀針的富集效率。通過膠圖和柱狀圖我們可以發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)產(chǎn)物的量隨著射時(shí)間的延長而明顯增加，當(dāng)照射時(shí)間超過 30 分鐘時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)著提高。因?yàn)樵?365 nm 紫外的照射下，雖然探針與 GST-SRCSH2蛋白交聯(lián)反應(yīng)，但是同時(shí)會(huì)因溫度的迅速升高產(chǎn)生蛋白的降解，影響富集得注意的是，與沒有紫外交聯(lián)的陰性對照相比，探針顯示目標(biāo)富集率，這意味著蛋白捕捉擁有紫外依賴性。在光照接近 30 min 時(shí)，探針SRCSH2蛋白交聯(lián)效率最好。因此我們選擇 30 min 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的光照條

探針 1（p-3）：FD-Bpa-PS-(pY)-VNVQNLK(Biotin)光間優(yōu)化，以最大強(qiáng)度為 100 計(jì)算系鹽離子的濃度優(yōu)化結(jié)合緩沖液的鹽濃度對特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用究了不同的結(jié)合緩沖液對目標(biāo)物富集率的影響[59]。如圖增加到 1×結(jié)合緩沖液，捕獲的目標(biāo)顯著增加，，鹽濃度過果明顯下調(diào)。因此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇 1×結(jié)合質(zhì)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R341

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本文編號：2690418