【摘要】：肝臟是一個固有免疫優(yōu)勢的器官,其中免疫細(xì)胞的組成與其他臟器不同,肝臟中含有大量的組織駐留的固有免疫細(xì)胞,如組織駐留NK細(xì)胞(Peng et al.,2013;Sojka et al.,2014),yδT細(xì)胞(Li et al.,2017)和NKT細(xì)胞(Thomas et al.,2011)。在本實驗室的前期研究中發(fā)現(xiàn)成年小鼠肝臟中的NK細(xì)胞可以根據(jù)CD49a和CD49b表達(dá)的不同分為兩個亞群:肝臟CD49a-CD49b+NK細(xì)胞能夠參與外周的血液循環(huán),與脾臟經(jīng)典NK細(xì)胞(conventional NK cells,cNK cells)相同;CD49a+CD49b-NK細(xì)胞具有肝臟組織駐留特性,被稱為肝臟駐留NK細(xì)胞(liver-resident NK cells,LrNK cells)(Peng et al.,2013)。已有實驗證據(jù)表明:成年小鼠的肝臟單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)輸可以挽救致死輻照小鼠的生命,并在其體內(nèi)重建正常比例和數(shù)目的LrNK細(xì)胞,而骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)輸后形成LrNK細(xì)胞數(shù)量顯著減少。提示LrNK細(xì)胞可能是由肝臟造血前體細(xì)胞發(fā)育分化而來的。隨后我們發(fā)現(xiàn)成年小鼠肝臟中有一群與胎肝造血干細(xì)胞表型Lin-Sca-1+Mac-l+(LSM)相同的細(xì)胞,這群細(xì)胞可以在肝臟發(fā)育成為CD49a+NK前體(CD49a+NK precursor,CD49a+NKP)細(xì)胞,從而發(fā)育為成熟的LrNK細(xì)胞,這些均提示LrNK細(xì)胞的形成與肝臟微環(huán)境密不可分。肝臟由于其特殊的生理結(jié)構(gòu)和血液來源,具有不同于其他臟器的細(xì)胞組成和細(xì)胞因子環(huán)境,肝臟微環(huán)境如何支持LrNK細(xì)胞的發(fā)育成熟仍有許多懸而未決的問題,本研究針對肝臟微環(huán)境對LrNK細(xì)胞發(fā)育分化的影響進(jìn)行了進(jìn)一步的探索,發(fā)現(xiàn)肝臟中的細(xì)胞因子IFN-γ和CD8+T細(xì)胞對LrNK細(xì)胞的發(fā)育分化及其成熟起到關(guān)鍵的作用。主要結(jié)果分為以下兩個方面:Ⅰ、IFN-γ調(diào)節(jié)肝臟駐留NK細(xì)胞的發(fā)育分化1、IFN-γ調(diào)節(jié)肝內(nèi)造血前體細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)本研究發(fā)現(xiàn)LrNK細(xì)胞的前體LSM細(xì)胞和CD49a+NKP細(xì)胞均表達(dá)IFN-γ受體1(CD119),提示LrNK細(xì)胞的發(fā)育分化依賴于IFN-y的信號。在IFN-γ缺陷的GKO小鼠中,肝臟造血前體LSM細(xì)胞數(shù)量顯著減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),IFN-y信號的缺失導(dǎo)致LSM細(xì)胞和CD49a+NKP細(xì)胞的增殖能力減弱。若給GKO小鼠恢復(fù)肝臟中的IFN-γ 平,則LSM細(xì)胞和CD49a+NKP細(xì)胞數(shù)量增加。說明IFN-y可以通過促進(jìn)肝內(nèi)造血前體細(xì)胞的增殖,從而導(dǎo)致其數(shù)量增加。2、IFN-γ促進(jìn)肝臟駐留NK細(xì)胞發(fā)育我們通過胎肝細(xì)胞混合轉(zhuǎn)輸?shù)膶嶒炞C明,來源于IFN-γ受體缺陷的GRKO小鼠的造血前體細(xì)胞不能發(fā)育出正常比例和數(shù)目的LrNK細(xì)胞,說明缺乏IFN-γ信號會導(dǎo)致LrNK細(xì)胞的發(fā)育受阻。說明IFN-γ可以促進(jìn)LrNK細(xì)胞的肝內(nèi)發(fā)育過程。3、IFN-γ信號缺失導(dǎo)致肝臟駐留NK細(xì)胞減少通過對GKO和GRKO小鼠肝臟中NK細(xì)胞的檢測,我們發(fā)現(xiàn)成年GKO和GRKO小鼠肝臟中的NK細(xì)胞比例和數(shù)目均有較為明顯的降低,主要體現(xiàn)在LrNK細(xì)胞的減少,而經(jīng)典NK細(xì)胞數(shù)量不變。GKO小鼠體內(nèi)殘留的少量LrNK細(xì)胞依然能夠保持其特有的表型和功能特征。上述結(jié)果提示IFN-γ的缺失導(dǎo)致成年小鼠LrNK細(xì)胞的減少。4、過表達(dá)IFN-γ使肝臟駐留NK細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)我們在GKO小鼠體內(nèi)過表達(dá)IFN-γ發(fā)現(xiàn),LrNK細(xì)胞比例和數(shù)目均有較為明顯的回升。類似的現(xiàn)象也在轉(zhuǎn)輸實驗中得到了證實。這些結(jié)果說明在表達(dá)IFN-γ的肝臟微環(huán)境中,GKO小鼠的前體細(xì)胞具有與正常鼠相同的發(fā)育潛力,可以發(fā)育成為正常比例和數(shù)量的LrNK細(xì)胞。5、IFN-γ對肝臟駐留NK細(xì)胞的作用依賴于T-bet我們通過胎肝細(xì)胞的體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IFN-γ可以增加野生型小鼠LrNK細(xì)胞的比例和數(shù)目。T.bet缺陷小鼠的胎肝細(xì)胞則無法發(fā)育形成LrNK細(xì)胞,在培養(yǎng)體系中加入IFN-γ仍然不能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。隨后我們在T-bet基因缺陷小鼠肝臟內(nèi)過表達(dá)了IFN-γ,在該小鼠體內(nèi)仍然無法檢測到LrNK細(xì)胞。提示IFN-γ對LrNK細(xì)胞發(fā)育的促進(jìn)作用需要轉(zhuǎn)錄因子T-bet的參與。結(jié)論Ⅰ:IFN-γ以T-bet依賴的方式增強肝內(nèi)造血前體細(xì)胞LSM和CD49a+NKP細(xì)胞的增殖,促進(jìn)LrNK細(xì)胞的發(fā)育分化。Ⅱ、CD8+T細(xì)胞促進(jìn)肝臟駐留NK細(xì)胞成熟1、CD27+肝臟駐留NK細(xì)胞可以向CD27-肝臟駐留NK細(xì)胞分化LrNK細(xì)胞上CD27分子異質(zhì)性的表達(dá),本研究發(fā)現(xiàn)隨著小鼠的個體發(fā)育成熟,LrNK細(xì)胞表達(dá)CD27分子的水平逐漸下調(diào),CD27-LrNK細(xì)胞比CD27+LrNK細(xì)胞更加成熟。體內(nèi)外實驗均表明,CD27+的LrNK細(xì)胞可以向CD27-的LrNK細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2、CD8+T細(xì)胞缺失導(dǎo)致CD27+肝臟駐留NK細(xì)胞增加在CD8缺陷的小鼠中,LrNK細(xì)胞數(shù)目無顯著變化,但表達(dá)CD27分子的水平升高。這一現(xiàn)象在Rag1缺陷小鼠中同樣存在,但在CD4+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞和B細(xì)胞缺陷小鼠體內(nèi)LrNK細(xì)胞的CD27表達(dá)均未發(fā)生改變。因此我們認(rèn)為CD8+T細(xì)胞的缺失特異性的增強LrNK細(xì)胞上CD27分子的表達(dá),導(dǎo)致成熟的CD27-LrNK細(xì)胞減少,不成熟的CD27+LrNK細(xì)胞增加。3、CD8+T細(xì)胞促進(jìn)CD27+肝臟駐留NK細(xì)胞向CD27-肝臟駐留NK細(xì)胞分化給CD8缺陷小鼠轉(zhuǎn)輸脾臟CD8+T細(xì)胞會使LrNK細(xì)胞表達(dá)CD27水平恢復(fù)正常,說明CD8+T細(xì)胞可以促進(jìn)LrNK細(xì)胞從CD27+向CD27-分化,促進(jìn)其成熟。體外培養(yǎng)的實驗進(jìn)一步說明CD8+T細(xì)胞對LrNK細(xì)胞發(fā)育的促進(jìn)作用是通過細(xì)胞與細(xì)胞相互接觸導(dǎo)致的。結(jié)論Ⅱ:我們發(fā)現(xiàn)CD27-LrNK細(xì)胞比CD27+LrNK細(xì)胞成熟。CD8+T細(xì)胞可以促進(jìn)CD27+LrNK細(xì)胞向CD27-LrNK細(xì)胞的分化,從而促進(jìn)LrNK細(xì)胞的成熟。
【圖文】：

肝臟中的血液來源主要有兩方面：約２０％的血液由肝動脈提供，主要是來自逡逑心臟的動脈血；８０％的血液由連接肝臟與小腸的肝門靜脈提供，其中含有大量的逡逑細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、環(huán)境毒素與外來食物抗原（圖１．１邋）（Ｖｏｌｌｍａｒ邋ａｎｄ邋Ｍｅｎｇｅｒ，２００９）。逡逑使肝臟持續(xù)的接受來源于細(xì)菌代謝物或外來抗原的刺激。逡逑Ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｓｙｓｔｅｍｉｃ邋ｖｅｎｏｕｓ邋ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ逡逑Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ：逡逑？邐Ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑？邐Ｌｉｐｉｄｓ逡逑？邐Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ逡逑Ａｃｕｔｅ邋ｐｈａｓｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑Ｉｎｆｅｒｉｏｒ邐邐逡逑ｖｅｎａ邋ｃａｖａ邋Ｉ逡逑ｚ．－．．．．逡逑ｒ－＾邐Ｐ邐Ｂｌｏｏｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ逡逑＾ｖｅｒ邐Ｗ邐ｉｒ邐ａｒｔｅｒｉａｌ邋ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ逡逑Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邐｜｜｜，邐邐—邐逡逑ａｎｄ邋ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ邐／逡逑Ｐｏｒｔａｌ邋ｖｅｉｎ邋＾？尅巧邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ逡逑＼Ｗ邐Ｃｏｍｍｏｎ邐．．．逡逑１邋ｒ邐ｂｉｌｅ邋ｄｕｃｔ邐＊邋Ａｇｅｄ邋ｏｒ邋ｄａｍａｇｅｄ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ｇｌｉｓｓｏｎ＇ｓ邐［？邋Ｔｏｘｉｃ邋ｒｏｍｐｏｎｅｎｔｓ逡逑ｃａｐｓｕｌｅ逡逑Ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｌｕｍｅｎ逡逑Ｂｉｌｅ邋ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ邋（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ｅｎｄ逡逑ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）逡逑圖１．邋１肝臟的生理學(xué)結(jié)構(gòu)（Ｔｈｏｍｓｏｎ邋ａｎｄ邋Ｋｎｏｌｌｅ，２０１０＞逡逑來自于門靜脈和肝動脈的血液在肝竇處匯集

ＮＫ細(xì)胞都會產(chǎn)生ＩＦＮ－丫，進(jìn)而輔助淋巴結(jié)中的Ｔ細(xì)胞應(yīng)答。ＮＫ細(xì)胞也會產(chǎn)生逡逑一些其他促炎因子如ＴＮＦ－ａ或抑炎因子如ＩＬ－１０來調(diào)控機體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答逡逑（圖１．３）。同時，ＮＫ細(xì)胞也可以分泌一系列趨化因子如ＣＣＬ２、ＣＣＫ３、ＣＣＬ４、逡逑ＣＣＬ５、ＸＣＬ１和ＣＸＣＬ８（Ｗａｌｚｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，，邋２００５），從而弓丨導(dǎo)ＤＣ細(xì)胞和Ｔ細(xì)胞遷移至逡逑炎癥部位以發(fā)揮其免疫學(xué)效應(yīng)（Ｍｏｒｅｔｔａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００５）。ＮＫ細(xì)胞對靶細(xì)胞的直接殺逡逑傷也會導(dǎo)致靶細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞碎片被抗原提呈細(xì)胞識別，提呈信號并激活ＣＤ８＋逡逑細(xì)胞毒性Ｔ細(xì)胞（圖１．３）。總而言之，ＮＫ細(xì)胞除了可以直接殺傷靶細(xì)胞之外，逡逑也可以通過細(xì)胞毒作用或細(xì)胞因子的分泌來促進(jìn)或抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答，對機體逡逑的免疫反應(yīng)起到調(diào)節(jié)的作用。逡逑５逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2690311