【摘要】：睡眠是一種自發(fā)的、可逆的行為狀態(tài),睡眠過程中伴隨著主觀意識下降,對外界刺激反應降低。睡眠行為高度保守,從低等動物到高等哺乳動物都具有睡眠及睡眠樣的行為。研究發(fā)現(xiàn),睡眠主要受到生物節(jié)律和睡醒穩(wěn)態(tài)兩個內(nèi)在系統(tǒng)調(diào)控。目前,對于哺乳動物的中央節(jié)律神經(jīng)元核團參與睡眠調(diào)控相關分子機制的研究不是很清晰。同時,研究人員發(fā)現(xiàn)果蠅中也存在睡眠樣行為,果蠅的節(jié)律系統(tǒng)與哺乳動物的同源性很高。因此本論文以果蠅為模式動物,運用了遺傳學、分子生物學、電生理技術以及行為學等生物手段解析了Fbxl4蛋白在腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)中動態(tài)表達,從而介導GABA_A受體節(jié)律性降解調(diào)節(jié)睡眠的相關分子機制。研究發(fā)現(xiàn),腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)的GABA_A受體在清晨和黃昏的含量不同,除了Wake蛋白在黃昏時對GABA_A受體募集作用外,主要是GABA_A受體在清晨和黃昏時分被降解的量不同,而GABA_A受體的具體被降解機制不是很清晰。通過RNAi篩選,我們發(fā)現(xiàn)Fbxl4蛋白水平降低后,GABA_A受體蛋白水平增加;隨后體內(nèi)體外泛素化實驗結果顯示Fbxl4介導GABA_A受體泛素化,并且這種降解作用主要發(fā)生在清晨時分。同時研究發(fā)現(xiàn)Fbxl4的轉(zhuǎn)錄水平是CLOCK依賴的,從而介導GABA_A受體的節(jié)律性降解。通過免疫熒光染色顯示,Fbxl4蛋白在清晨時分(ZT0)表達量最高黃昏時分(ZT12)表達量較低,而Fbxl4對GABA_A受體的降解是劑量依賴的,所以這暗示Fbxl4蛋白在清晨時分(ZT0)對GABA_A受體降解量較多。之前研究報道,腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)上GABA_A受體的數(shù)量會影響細胞的興奮性。通過電生理全細胞記錄腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)的自發(fā)放電模式,結果顯示與野生型相比,fbxl4突變體的腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)的動作電位自發(fā)放電頻率更低,這說明Fbxl4蛋白缺失會降低腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)細胞活性。而飽和GABA噴射實驗結果顯示fbxl4突變體中GABA電流幅度更大,暗示著Fbxl4蛋白缺失后腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)細胞膜上的GABA_A受體數(shù)量比野生型更多,從而影響了腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)的細胞活性。因此,我們對野生型和fbxl4突變體果蠅的睡眠行為檢測時發(fā)現(xiàn),fbxl4突變體的睡眠基線比野生型高,睡眠潛伏期比野生型短。不僅如此,fbxl4突變體可以部分挽救腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)中GABA_A受體減少睡眠降低的表型,進一步說明Fbxl4蛋白對GABA_A受體節(jié)律性降解來調(diào)控睡眠。本論文研究揭示了fbxl4基因轉(zhuǎn)錄水平受到重要節(jié)律分子CLOCK調(diào)控,而Fbxl4蛋白在腹外側(cè)神經(jīng)元(l-LNvs)中節(jié)律性降解GABA_A受體,從而對睡眠具有調(diào)控作用。這項研究闡明了節(jié)律系統(tǒng)怎樣通過調(diào)控下游分子Fbxl4蛋白的動態(tài)變化,從而調(diào)控睡眠和覺醒的發(fā)生,為節(jié)律系統(tǒng)如何影響睡眠穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的研究搭建了橋梁,提供了新的研究線索。
【圖文】：

維也納神經(jīng)學家Baron Constantin von Economo發(fā)現(xiàn)腦炎患者伴隨著過度嗜睡的問題，雖然他沒有鑒定出感染腦炎的致病病毒，但是von Economo仔細描繪了被該病毒所破壞的腦區(qū)（圖1-1 A），并且他提出一個假設：在腦干區(qū)域存在上行覺醒系統(tǒng)對維持前腦的覺醒有著非常重要的作用。幾十年后，人們證實了von圖 1-1：上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)的解剖結構（A）人的腦干結構圖（摘自 von Economo 的手稿）（B）上行覺醒系統(tǒng)相關核團的示意圖（C）腹外側(cè)視前核 VPLO 對上行覺醒系統(tǒng)核團的投射示意圖A B C

人們嘗試用flip-flop轉(zhuǎn)化模型來解釋睡眠和覺醒的關系（圖1-2）[21, 35,36]，控制覺醒的單胺類神經(jīng)元核團與腹外側(cè)視前核互相具有抑制作用。在覺醒時，單胺類核團神經(jīng)元（圖1-2 A 紅色區(qū)域）對腹外側(cè)視前核（VLPO）的抑制作用大于腹外側(cè)視前核對單胺類核團的抑制作用（圖1-2 A 紫色區(qū)域），此時食欲素（orexin）神經(jīng)元（圖1-2 A 綠色區(qū)域）會釋放食欲素，，食欲素是一種神經(jīng)肽，分泌食欲素的神經(jīng)元核團僅僅存在下丘腦外側(cè)區(qū)（LHA）的后半側(cè)。由于腹外側(cè)視前核上沒有食欲素的受體，食欲素神經(jīng)元分泌的食欲素只作用于單胺能神經(jīng)元，從而激活單胺能神經(jīng)元促進覺醒；而當睡眠發(fā)生時，腹外側(cè)視前核（VLPO）對單胺類神經(jīng)元核團群的抑制作用占主導，腹外側(cè)視前核（VLPO）釋放的 -羥基丁酸（GABA）不僅對單胺類神經(jīng)元有抑制作用，同時也能抑制食欲素神經(jīng)元活性，從而進一步抑制了單胺類神經(jīng)核團的活性，導致睡眠的發(fā)生。1.1.3 睡眠中樞神經(jīng)元的調(diào)控作用許多研究證明
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R338

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本文編號：2686842