本文關(guān)鍵詞：GⅡ-4型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關(guān)性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的分析GII-4型諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列,了解其基因結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)以及基因組類型。應(yīng)用分子生物學(xué)手段制備GII-4型No V P粒子,通過(guò)酶免疫分析試驗(yàn)(Enzyme immune assays,EIA)為基礎(chǔ)的唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)和寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析我國(guó)主要基因型95/96 US株、2006b株、Sydney株等3種毒株與組織血型抗原(Histo-blood group antigens,HBGAs)的相關(guān)性,以獲得我國(guó)No V流行株與HBGAs的結(jié)合模式,從而確定諾如病毒流行株感染的宿主范圍,為進(jìn)一步研究No V與宿主受體之間的關(guān)系及No V疫苗和防治藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法1諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測(cè)定及分析:依據(jù)Sydney2012全基因組參考株進(jìn)行引物的設(shè)計(jì),用RT-PCR分段的方式對(duì)諾如病毒全基因組進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)過(guò)分子克隆的手段、測(cè)序以后再進(jìn)行系統(tǒng)的進(jìn)化分析。2制備GII-4型諾如病毒P粒子:選擇Sydney2012代表株3135,通過(guò)基因工程方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p GEX4T1-P,將鑒定正確的p GEX4T1-P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌,挑選單克隆菌落小量表達(dá),SDS-PAGE鑒定是否有融合蛋白產(chǎn)生。隨后將保存菌種活化進(jìn)行目的蛋白的大量表達(dá),利用瓊脂糖-4B柱對(duì)P蛋白進(jìn)行純化并通過(guò)凝血酶除去GST融合蛋白標(biāo)簽以形成二十四聚體的P粒子。3分析不同型別諾如病毒株與組織血型抗原的親和性:利用ELISA唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析3個(gè)型別的諾如病毒流行株與唾液中的HBGAs受體相結(jié)合的情況。利用HBGAs表型已明確的54份唾液樣本包被96孔酶標(biāo)板,加純化的No V P粒子與之反應(yīng),以相應(yīng)的鼠抗GII-4 No V P血清為一抗,二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗鼠Ig G,加入TMB顯色液,在酶標(biāo)儀上的450nm波長(zhǎng)處顯示的OD值。通過(guò)3個(gè)毒株的P蛋白對(duì)lea、leb、lex、ley、A、B、H1和H2型寡糖進(jìn)行EIA為基礎(chǔ)的寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)。綜合唾液結(jié)合及寡糖結(jié)合的實(shí)驗(yàn)分析三個(gè)諾如病毒流行株與HBGAs受體的結(jié)合方式。結(jié)果1諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測(cè)定及分析:GII-4型諾如病毒廣州株GZ20133135病毒基因組全長(zhǎng)7566bp,其病毒基因組分為三個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs),ORF1、ORF2及ORF3長(zhǎng)度分別為5100bp、1623bp和807bp,ORF1與ORF2之間有19個(gè)核苷酸重疊。廣州株GZ20133135全基因組的序列與參考株GII-4型Sydney2012變異株序列的同源性最高,全長(zhǎng)同源性為99.07%。通過(guò)系統(tǒng)的進(jìn)化分析表明,廣州株GZ20133135株屬于GII-4 Sydney2012的變異株。通過(guò)對(duì)衣殼區(qū)541個(gè)氨基酸比對(duì),Sydney2012變異株位點(diǎn)變化情況為:aa294 V或A或P→T,aa296 S或T→S,aa297H或Q→R,aa298D或N或T→N,aa368 T或N或S或A→E,aa372 N或S→D,aa393 N或D或S,aa394 T或G或S→T,aa395 T或A→T,aa407 N或D→S,aa412 T或D→N,aa413 G或I→T。2制備GII-4型諾如病毒P粒子:PCR擴(kuò)增得到3135 P區(qū)序列,大小都為991bp。成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒4T1-3135 P,測(cè)序結(jié)果證實(shí)連接的表達(dá)片段長(zhǎng)為972個(gè)核苷酸,編碼324個(gè)氨基酸。SDS-PAGE電泳分析證實(shí)成功表達(dá)了分子量約62k Da的可溶性的GST-P融合蛋白和分子量為36k Da的目的蛋白P蛋白。3分析不同型別諾如病毒株與組織血型抗原的親和性:通過(guò)P蛋白的唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析得到3135-P、9711-P和55019-P諾如病毒與唾液HBGAs的結(jié)合模式。9711及55019株的P粒子與A、B、AB、O+型唾液能夠結(jié)合,而與O-型唾液則均不結(jié)合。3135株P(guān)粒子與A、B、AB、O+、O-型唾液均結(jié)合。通過(guò)寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3135與lea、leb、A、B、H2型結(jié)合;55019與leb、ley、A、B、H2型寡糖結(jié)合;9711與leb、ley、A、B型寡糖結(jié)合。結(jié)論1廣州株GZ20133135株屬于GII-4 Sydney2012變異株;2成功構(gòu)建諾如病毒表達(dá)質(zhì)粒4T1-3135 P,并獲得目的蛋白P粒子;3 HBGAs與3135、9711和55019 GII-4型No V的結(jié)合呈現(xiàn)毒株特異性。由唾液及寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)綜合分析發(fā)現(xiàn)9711株及55019株的P粒子與A、B、AB、O+血型唾液能夠結(jié)合,與O-血型唾液則均不發(fā)生結(jié)合。3135株P(guān)粒子與A、B、AB、O+、O-血型唾液均結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：諾如病毒 GII-4型 組織血型抗原 結(jié)合模式
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第1章 諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測(cè)定及分析14-26
• 1.1 材料與方法14-20
• 1.1.1 標(biāo)本14
• 1.1.2 主要試劑14
• 1.1.3 主要溶液配制14-15
• 1.1.4 主要儀器15-16
• 1.1.5 標(biāo)本處理16
• 1.1.6 病毒核酸的提取16
• 1.1.7 病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄16-17
• 1.1.8 病毒基因組擴(kuò)增17-18
• 1.1.9 結(jié)果鑒定18-20
• 1.2 結(jié)果20-23
• 1.2.1 諾如病毒基因組結(jié)構(gòu)特征20
• 1.2.2 諾如病毒基因組全序列比較20-21
• 1.2.3 1991年至今諾如病毒GII-4 型變異株ORF2區(qū)氨基酸位點(diǎn)變化情況分析101.3 討論21-23
• 1.4 結(jié)論23
• 參考文獻(xiàn)23-26
• 第2章 GII-4 型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關(guān)性研究26-46
• 2.1 材料和方法26-37
• 2.1.1 材料26-28
• 2.1.2 擴(kuò)增廣州新爆發(fā)Sydney代表株 3135 P區(qū)基因序列28-29
• 2.1.3 pGEM-T Easy-P的TA克隆29-31
• 2.1.4 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T1-P31-32
• 2.1.5 表達(dá)目的蛋白32-33
• 2.1.6 GST融合蛋白的純化33-34
• 2.1.7 唾液表型測(cè)定34-35
• 2.1.8 EIA檢測(cè)P蛋白與HBGAs受體的結(jié)合35-36
• 2.1.9 寡糖結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.2 結(jié)果37-42
• 2.2.1 擴(kuò)增GII-4 型NVs P區(qū)基因序列37
• 2.2.2 構(gòu)建PGEM-Teasy-P重組質(zhì)粒37-38
• 2.2.3 構(gòu)建PGEM-4T1-P表達(dá)質(zhì)粒38
• 2.2.4 P蛋白的小量表達(dá)38-39
• 2.2.5 P蛋白的大量表達(dá)及純化39
• 2.2.6 唾液表型測(cè)定39-40
• 2.2.7 EIA檢測(cè)P蛋白與HBGAs受體的結(jié)合40-42
• 2.2.8 寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)42
• 2.3 討論42-45
• 2.4 結(jié)論45
• 參考文獻(xiàn)45-46
• 第3章 綜述46-59
• 3.1 諾如病毒基因組特征46
• 3.2 諾如病毒蛋白質(zhì)46-47
• 3.2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白46-47
• 3.2.2 結(jié)構(gòu)蛋白47
• 3.3 諾如病毒與宿主的相互作用47-49
• 3.4 諾如病毒流行病學(xué)特征49-50
• 3.5 諾如病毒感染的臨床表現(xiàn)50
• 3.6 諾如病毒檢測(cè)方法50-52
• 3.6.1 電鏡法50-51
• 3.6.2 免疫學(xué)方法51
• 3.6.3 分子生物學(xué)方法51-52
• 3.7 治療、預(yù)防及疫苗的研究52-53
• 3.8 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 結(jié)論59-60
• 致謝60-61
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介61-62
• 作者簡(jiǎn)介62-63
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集63

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 譚冬梅;劉巍;;諾如病毒GⅡ.4基因型的流行變遷和進(jìn)化機(jī)制[J];應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年01期

2 楊翼龍;譚小華;廖偉東;;1起社區(qū)水源性諾如病毒感染性腹瀉暴發(fā)疫情的流行病學(xué)調(diào)查[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年02期

3 李琛;廖煥金;蘭巧芬;盛慧英;葉玲;李亞寧;王剛;潘慶軍;;創(chuàng)新型諾如病毒GⅠ/GⅡ抗原熒光納米顆粒快速聯(lián)檢試紙條檢測(cè)效能測(cè)評(píng)[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2015年06期

4 陳敏玫;周開(kāi)姣;居昱;譚毅;;2012年廣西首次檢出諾如病毒GⅡ.4 Sydney變異株[J];疾病監(jiān)測(cè);2014年01期

5 林迪;孫長(zhǎng)貴;;諾如病毒感染及其實(shí)驗(yàn)室檢查[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2015年01期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 戴迎春;基于P顆粒的諾如病毒GII.4型流行株進(jìn)化機(jī)制及免疫保護(hù)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

2 馬麗萍;貝類中諾如病毒的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及與組織血型抗原相關(guān)性[D];上海海洋大學(xué);2013年

3 薛亮;諾如病毒GⅡ型流行株基因組特征分析及進(jìn)化機(jī)制研究[D];華南理工大學(xué);2013年

4 鐘雪飛;重慶地區(qū)兒童病毒性腹瀉病原分子流行病學(xué)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

5 賽林濤;濟(jì)南成人諾如病毒感染及兒童輪狀與諾如病毒感染特征比較的研究[D];山東大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 張翠紅;GⅡ-4型諾如病毒P粒子的表達(dá)及其與組織血型抗原結(jié)合的初步研究[D];南華大學(xué);2013年

2 趙德堅(jiān);深圳地區(qū)C組輪狀病毒和G1型小雙節(jié)RNA病毒的分子進(jìn)化分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

3 田勝男;小鼠諾如病毒檢測(cè)方法的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

4 趙進(jìn);重慶地區(qū)門(mén)診兒童急性腹瀉相關(guān)病毒的流行特征與基因特征研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

5 周鈺瀅;五味子酒劑的研制[D];哈爾濱商業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：GⅡ-4型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：268631