本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌PAO1中C-di-GMP代謝基因的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1中第二信使分子環(huán)鳥苷二磷酸(cyclic di-guanylate mono-phosphate,c-di-GMP)代謝相關(guān)的基因進(jìn)行研究及探討,以期加深對(duì)銅綠假單胞菌致慢性感染的相關(guān)分子機(jī)制的理解。方法從同行實(shí)驗(yàn)室獲得PAO1野生型菌株及多個(gè)C-di-GMP代謝相關(guān)的具有GGDEF、EAL及GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域基因的轉(zhuǎn)座子突變體菌株。首先采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR),以來確認(rèn)各個(gè)突變菌株的轉(zhuǎn)座子插入情況。之后對(duì)轉(zhuǎn)座子突變菌株進(jìn)行生物膜(Biofilm)和泳動(dòng)性(Motility)表型分析,通過表型的變化,篩選出感興趣的基因。利用PCR技術(shù)將相關(guān)基因的催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行克隆以及構(gòu)建原核表達(dá)載體。成功構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo),進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)及分析。選擇溶解性良好的重組蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性分析,使用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)的方法,參照標(biāo)準(zhǔn)品以及文獻(xiàn),以分析重組蛋白的催化活性。結(jié)果1.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn),使用轉(zhuǎn)座子特異引物及基因特異引物,得到明亮清晰的條帶,確認(rèn)轉(zhuǎn)座子插入預(yù)期的基因位點(diǎn)中,導(dǎo)致其失活成為突變菌株;而無明亮條帶出現(xiàn)的則為插入失活失敗,即為非轉(zhuǎn)座子插入菌株。2.對(duì)野生型PAO1菌株和篩選出的四個(gè)GGDEF-EAL突變菌株進(jìn)行Biofilm表型分析比較。在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12小時(shí)的各株細(xì)菌,經(jīng)結(jié)晶紫染色,生物膜定量分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,與野生型PAO1相比,PA0285、PA0575、PA5442基因插入失活,導(dǎo)致生物膜變化差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而PA5295變化不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.對(duì)野生型PAO1菌株和四個(gè)GGDEF-EAL突變菌株進(jìn)行Motility表型分析,測(cè)量同一平板上的野生型PAO1和轉(zhuǎn)座子突變體菌株的菌落直徑。PA0285、PA0575、PA5442轉(zhuǎn)座子突變體菌落直徑與野生型PAO1間具有顯著差異(P0.05),而PA5295轉(zhuǎn)座子突變體與PAO1間無顯著差異(P0.05)。4.綜合分析多個(gè)轉(zhuǎn)座子突變菌株的表型分析,輔以大量相關(guān)研究文獻(xiàn),對(duì)尚未研究報(bào)道而我們感興趣的多個(gè)GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)行克隆,轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α中并驗(yàn)證是否構(gòu)建成功。測(cè)序驗(yàn)證后再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21,以IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白,并用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。5.選取體外表達(dá)的可溶性蛋白PA0847,進(jìn)行體外生物學(xué)活性分析,使用高效液相色譜技術(shù)對(duì)蛋白的體外催化活性進(jìn)行檢測(cè),得出其在體外有鳥甘酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)的活性,即PA0847的GGDEF結(jié)構(gòu)域在體外表現(xiàn)出了C-di-GMP合成酶的活性。結(jié)論研究者們已知具有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域的基因涉及細(xì)菌中第二信使C-di-GMP的合成與分解,并影響細(xì)菌的諸多生理功能。為了進(jìn)一步了解這些相關(guān)基因是通過何種分子機(jī)制來影響細(xì)菌的生理過程,我們對(duì)GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行表型的初步分析,挑選出在表型上有顯著差異的基因,經(jīng)基因克隆和相關(guān)蛋白的表達(dá)分析,選取PA0847基因進(jìn)行體外催化活性分析。最終我們驗(yàn)證了PA0847蛋白的DGC活性,這為我們深入分析PA0847的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為我們進(jìn)一步理解C-di-GMP在銅綠假單胞菌中的生物學(xué)功能提供一些啟示。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌PAO1 C-di-GMP Biofilm Motility DGC
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 中英文縮略詞表8-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-28
• 1. 材料12-14
• 1.1 菌株12
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器12-13
• 1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑13-14
• 1.4 實(shí)驗(yàn)中主要試劑配制14
• 2. 方法14-27
• 2.1 突變體菌株的轉(zhuǎn)座子插入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證14-18
• 2.2 細(xì)菌生物膜（Biofilm）和泳動(dòng)性（Motility）的表型分析18
• 2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)18-25
• 2.4 蛋白體外活性分析25-27
• 3. 統(tǒng)計(jì)分析與數(shù)據(jù)處理27-28
• 結(jié)果28-36
• 1 通過PCR驗(yàn)證PAO1突變菌株中基因的插入失活28
• 2 PAO1轉(zhuǎn)座子突變菌株Biofilm表型分析28-29
• 3 PAO1轉(zhuǎn)座子突變菌株Motility表型分析29-31
• 4 4個(gè)GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域基因的分析31-34
• 4.1 野生型PAO1及4個(gè)突變菌株的Biofilm表型分析31-32
• 4.2 野生型PAO1及4個(gè)突變菌株的Motility表型分析分析32
• 4.3 野生型及4個(gè)突變菌株的重組蛋白表達(dá)分析32-34
• 5 多個(gè)基因催化結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá)34
• 6 利用HPLC對(duì)PA0847的催化活性進(jìn)行分析34-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 綜述45-59
• 綜述參考文獻(xiàn)54-59
• 致謝59-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文60-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷61

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本文編號(hào)：268616