【摘要】：組蛋白翻譯后修飾是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,決定細(xì)胞命運(yùn),其異常表達(dá)往往與人類許多重大疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)為,組蛋白修飾發(fā)揮功能的重要途徑之一是通過招募特異性結(jié)合蛋白,進(jìn)而調(diào)控下游的生物學(xué)活動(dòng),因此組蛋白修飾結(jié)合蛋白的鑒定對了解其表觀遺傳調(diào)控有著重要的生物學(xué)意義。然而,由于組蛋白修飾是動(dòng)態(tài)變化的、修飾結(jié)合蛋白的豐度通常很低、修飾與其結(jié)合蛋白間的相互作用力弱且通常是瞬時(shí)的,因此人們對組蛋白修飾結(jié)合蛋白的了解遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于修飾的研究,這在一定程度上阻礙了人們對修飾,尤其是新修飾的深入認(rèn)識。本文構(gòu)建了一種自組裝光親和多肽探針,該探針通過自組裝技術(shù)同時(shí)將多肽和光交聯(lián)基團(tuán)連接到納米金上,以多肽為誘餌,通過光交聯(lián)反應(yīng)將弱的非共價(jià)作用轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的共價(jià)鍵,提高結(jié)合蛋白的捕獲。同時(shí),光交聯(lián)基團(tuán)二苯甲酮和納米金之間以聚乙二醇連接,通過對聚乙二醇長度和量的優(yōu)化使光交聯(lián)基團(tuán)處于更優(yōu)的空間位置,可以達(dá)到更優(yōu)的光交聯(lián)效果。在此基礎(chǔ)上,我們將探針富集與蛋白質(zhì)組學(xué)方法相結(jié)合,用帶有修飾的多肽飾探針和不帶修飾的多肽探針(對照)分別從核蛋白中富集結(jié)合蛋白,通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將修飾的特異性結(jié)合蛋白從背景蛋白中分辨出來。我們將該方法首先運(yùn)用到已知結(jié)合蛋白相對較多H3K4me3上,富集到了一些H3K4me3已知的直接和間接結(jié)合蛋白,驗(yàn)證了該方法的可行性。組蛋白賴氨酸β-羥基丁酰化(β-hydroxybutyrylation,bhb)、2-羥基異丁酰化(2-hydroxyisobutyrylation,hib)以及巴豆�；�(crotonylation,cr)都是近幾年發(fā)現(xiàn)的新的賴氨酸修飾形式,其中賴氨酸β-羥基丁酰化發(fā)現(xiàn)最晚,該修飾不改變賴氨酸的電性,所以它很可能主要通過招募結(jié)合蛋白發(fā)揮功能,且其結(jié)合蛋白目前未見報(bào)道。因此我們將上述發(fā)展的方法應(yīng)用到了H3K9bhb上,通過探針富集和質(zhì)譜定量,結(jié)合相關(guān)生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)了H3K9bhb的潛在結(jié)合蛋白ENL,通過PRM和western blot驗(yàn)證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,并通過計(jì)算機(jī)模擬分子對接實(shí)驗(yàn)解釋了ENL識別K9bhb的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。我們也將該方法應(yīng)用到了H3K9hib及H3K9cr上,富集到了已知的結(jié)合蛋白的以及未報(bào)道的潛在結(jié)合蛋白,并借助生物信息學(xué)工具對這些結(jié)合蛋白進(jìn)行了分子功能、細(xì)胞組分、生物過程的分析。由于這三種修飾在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性,我們對這三種探針富集到結(jié)合蛋白的異同進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,我們的自組裝光親和多肽探針富集,結(jié)合基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法在研究組蛋白修飾與其結(jié)合蛋白的相互作用方面有著重要的應(yīng)用潛力。
【圖文】：

證新方法的可行性。為了找到 H3K4me3 的結(jié)合蛋白，研究者基于蛋白 INPHD結(jié)構(gòu)域與H3K4me3多肽復(fù)合物形成的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了多肽探針（探針 1）。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，多肽與蛋白之間的相互作用主要涉及多肽的個(gè)氨基酸殘基（即 ARTKme3QT），因此光交聯(lián)基團(tuán)二苯甲酮被置于第 7 個(gè)酸丙氨酸上，該位點(diǎn)位于介導(dǎo)相互作用的位點(diǎn)附近，而且不干擾修飾與蛋之間的相互作用。此外，還在多肽的碳端引入了炔基，炔基可以通過生物反應(yīng)結(jié)合上熒光標(biāo)簽（如羅丹明）或親和標(biāo)簽（如生物素），這兩種標(biāo)簽分以用于實(shí)現(xiàn)蛋白的可視化或?qū)Φ鞍走M(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，探針 1 在單一蛋白質(zhì)水平或從復(fù)雜蛋白體系人細(xì)胞裂解液中標(biāo)記幾種已知的重組源 H3K4me3 結(jié)合蛋白，如 ING2，BPTF 和 JMJD2A。此外，這種基于光交方法也可用于尋找其他組蛋白修飾的結(jié)合蛋白。例如，已知的人 H3K9me3蛋白 HP1 就可以被基于 H3K9me3 的光親和探針（探針 2，圖 1）選擇性捕5]。同樣的探針也能從裂殖酵母的細(xì)胞裂解液中特異性的標(biāo)記人 HP1 蛋白的蛋白 Swi6，這表明這種化學(xué)方法也可以用于分析遺傳相對簡單的模式生物修飾依賴性蛋白-蛋白相互作用。

一種化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，該方法將光交聯(lián)策略與 SILAC 技術(shù)相結(jié)合，稱為CLASPI（交聯(lián)輔助和 SILAC 為基礎(chǔ)的蛋白鑒定，如圖 2）。將 CLASPI 方法應(yīng)用于分析 H3K4me3 結(jié)合蛋白中，將探針 1 和無修飾的對照探針（探針 C，圖 1）分別與“輕”細(xì)胞全蛋白（細(xì)胞生長在含有天然同位素豐度形式的培養(yǎng)基中）和“重”細(xì)胞全蛋白（培養(yǎng)細(xì)胞所用培養(yǎng)基中精氨酸和賴氨酸上的碳和氮分別被13C 和15N 取代）孵育。在光交聯(lián)后，將“輕”和“重”蛋白裂解液混合并通過 CuAAC 反應(yīng)在多肽探針上連接上生物素，用于純化捕獲到的蛋白質(zhì)，，通過SDS-PAGE 分離并用胰蛋白酶消化后，用 HPLC-MS / MS 分析所得多肽�！拜p比重”（L / H）比值較高的蛋白被認(rèn)為是 H3K4me3 的特異性結(jié)合蛋白。通過使用該方法，研究者從人 HeLa 細(xì)胞裂解液中鑒定了許多已知的 H3K4me3 結(jié)合蛋白，更重要的是，還發(fā)現(xiàn)了幾種之前未被報(bào)道的 H3K4me3 結(jié)合蛋白，包括 MORC3和 SPIN1，并通過體外等溫?zé)崃康味ㄔ囼?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些蛋白與 H3K4me3 修飾之間存在相互作用。隨后，有研究者揭示了 SPIN1 與組蛋白 H3K4me3 的結(jié)合與 Wnt 信號激活相關(guān)[28]。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R346

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本文編號：2670086