發(fā)布時間：2017-03-25 07:06

  本文關(guān)鍵詞：MDA5及RNA解旋酶A參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞為了應(yīng)對外界多種多樣的的刺激(諸如病毒感染,熱刺激,氧化刺激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,紫外線照射等),演化出了許多應(yīng)對這些刺激的機(jī)制。這些機(jī)制主要包括:固有免疫,應(yīng)激顆粒(Stress Granule,SG)的形成以及自噬的發(fā)生等。固有免疫作為一個經(jīng)典的應(yīng)激機(jī)制,其主要是通過一些固有的模式識別受體識別外來的侵入者,并激活下游的效應(yīng)通路。例如病毒感染就是主要被細(xì)胞膜上的Toll樣受體(Membrane-bound Toll-like receptors,TLRs)以及細(xì)胞內(nèi)的RIG-I樣受體(RIG-I-like receptors,RLRs)識別。其中RIG-I樣受體家族包括兩個主要的識別受體:視黃酸誘導(dǎo)基因-I(Retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)和黑色素瘤分化基因5(Melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)。應(yīng)激顆粒形成是細(xì)胞應(yīng)對外界刺激的另一個應(yīng)激機(jī)制。靜息的細(xì)胞中,胞內(nèi)m RNA通過一系列的調(diào)控維持自身的穩(wěn)定、定位并完成翻譯的過程。而當(dāng)細(xì)胞的翻譯過程在外界壓力的干擾下停止后,停止翻譯的m RNA會被募集入胞質(zhì)中的顆粒復(fù)合物中(例如SG)以保護(hù)其不被細(xì)胞內(nèi)的酶所水解。自噬是細(xì)胞進(jìn)化過程中高度保守的一個細(xì)胞應(yīng)激機(jī)制,其通過降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和錯誤折疊的蛋白來維持細(xì)胞內(nèi)平衡。自噬的過程主要是通過自噬體將待降解的物質(zhì)包裹起來后,與細(xì)胞中的溶酶體相結(jié)合,隨后這些物質(zhì)即會被溶酶體內(nèi)的水解酶所降解。本實(shí)驗(yàn)室前期證明RNA解旋酶A(RNA helicase A,RHA)與SG起始因子蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)發(fā)生相互作用;并發(fā)現(xiàn)固有免疫蛋白IFN-β啟動刺激因子-1(innate immune adaptor IFN-βpromoter stimulator,IPS-1)參與ds RNA誘導(dǎo)形成SG的過程,表明細(xì)胞內(nèi)不同應(yīng)激機(jī)制之間存在著一定的聯(lián)系。為了進(jìn)一步研究探討SG形成與固有免疫、自噬的發(fā)生之間的關(guān)系,本研究利用一個氧化應(yīng)激刺激物羰基氰化間氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)進(jìn)行了細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn),檢測分析了固有免疫蛋白在其中的調(diào)控機(jī)制;最后,我們通過進(jìn)一步確定了RHA與PKR相互作用在細(xì)胞SG形成中的作用機(jī)制。第一部分MDA5對CCCP誘導(dǎo)的自噬和應(yīng)激顆粒的調(diào)控的研究研究目的:通過使用CCCP刺激細(xì)胞,探索不同免疫蛋白對其誘導(dǎo)的SG的影響,進(jìn)一步研究SG形成與固有免疫的關(guān)系;同時,檢測這些免疫蛋白是否對CCCP誘導(dǎo)的自噬有影響。研究內(nèi)容:1.通過si RNA(si PKR,si IPS-1,si RIG-I,si MDA5)在A549和He La細(xì)胞中沉默相應(yīng)的蛋白,Western blotting檢測si RNA的沉默水平;使用CCCP刺激細(xì)胞,免疫熒光(IF)檢測經(jīng)TIA-1,G3BP1和TIAR染色的SG的細(xì)胞百分率。2.使用CCCP分別刺激MDA5沉默的A549和He La細(xì)胞,Western blotting檢測e IF2α的磷酸化水平。3.分別使用CCCP,poly(I:C),hippuristanol和熱激刺激細(xì)胞,IF檢測TIA-1或G3BP1和MDA5的共染色情況。4.使用CCCP,雷帕霉素和饑餓分別刺激沉默或未沉默MDA5的細(xì)胞,Western blotting和IF檢測細(xì)胞中LC3-I和LC3-II的水平;雷帕霉素和饑餓處理組作為對照。5.通過si RNA沉默細(xì)胞中的G3BP1后,使用CCCP刺激細(xì)胞A549和He La細(xì)胞,Western blotting和IF檢測細(xì)胞中LC3的水平。研究結(jié)果:1.WB結(jié)果顯示si RNA可有效沉默細(xì)胞中的靶蛋白水平,IF結(jié)果顯示si MDA5-1和si MDA5-2以及si MDA-mix能夠降低MDA5蛋白的表達(dá)。MDA5沉默細(xì)胞中SG陽性細(xì)胞百分比明顯低于轉(zhuǎn)染了si NC組的細(xì)胞,而沉默了RIG-I,PKR,IPS-1的細(xì)胞,SG陽性細(xì)胞百分比并沒有發(fā)生明顯的變化。2.CCCP刺激可引起e IF2α的磷酸化;而MDA5沉默的細(xì)胞中,磷酸化水平與對照組相比并沒有發(fā)生明顯的變化。3.在CCCP,poly(I:C),hippuristanol和熱激刺激后,細(xì)胞里出現(xiàn)TIA-1和G3BP1形成細(xì)胞質(zhì)顆粒;但MDA5蛋白并沒有形成顆粒。4.與對照組相比,受到CCCP,雷帕霉素和饑餓刺激的細(xì)胞的LC3-II/actin的比率明顯升高。而當(dāng)MDA5沉默后,CCCP組升高的LC3-II/actin比率發(fā)生了明顯的下調(diào),這種下調(diào)并沒有出現(xiàn)在雷帕霉素和饑餓刺激的細(xì)胞組內(nèi)。5.轉(zhuǎn)染了si G3BP1的細(xì)胞中LC3-II/actin的比率明顯低于對照細(xì)胞。結(jié)論:1.MDA5在CCCP誘導(dǎo)SG的形成過程中有著重要的作用。2.MDA5并沒有影響e IF2α的磷酸化,其調(diào)控SG形成的位點(diǎn)位于e IF2α的下游通路中。3.MDA5并不是CCCP誘導(dǎo)的SG組成成分。4.MDA5參與了CCCP誘導(dǎo)的自噬過程。5.CCCP誘導(dǎo)的自噬可能依賴于SG的形成。綜上所訴,本研究發(fā)現(xiàn)了固有免疫蛋白MDA5參與CCCP誘導(dǎo)SG和細(xì)胞自噬的過程,為證明細(xì)胞不同應(yīng)激過程存在著聯(lián)系提供了證據(jù)。第二部分RHA參與細(xì)胞顆粒形成的研究研究目的:使用免疫熒光的方法,進(jìn)一步分析RHA與PKR相互作用的結(jié)構(gòu)域;確定RHA,PKR和SG三者之間的相互關(guān)系,闡明RHA與PKR相互作用的模式和影響因素。研究內(nèi)容:1.通過免疫熒光檢測poly(I:C)刺激誘導(dǎo)情況下,RHA與PKR的細(xì)胞定位情況。2.分別克隆帶有GFP標(biāo)簽的RHA N端、解鏈酶核心區(qū)以及C端的分段克隆(RHAN-GFP、RHAM-GFP和RHAC-GFP)和帶有m Cherry標(biāo)簽的PKR N端及C端的克隆(m Cherry-PKRN和m Cherry-PKRC)分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,poly(I:C)處理檢測其進(jìn)入SG的區(qū)段。3.將帶有GFP標(biāo)簽的RHA N端和帶有m Cherry標(biāo)簽的PKR N端共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,使用poly(I:C)處理,檢測其共定位情況。4.通過免疫熒光檢測poly(I:C)刺激誘導(dǎo)情況下,RHA和PKR分別與SG的兩個組分TIA-1和G3BP1的共定位情況。5.通過si RNA沉默細(xì)胞中的PKR,RHA后,poly(I:C)刺激細(xì)胞,免疫熒光檢測胞內(nèi)PKR,RHA,TIA-1,G3BP1顆粒的形成情況。研究結(jié)果:1.在poly(I:C)刺激的細(xì)胞中,RHA和PKR在胞質(zhì)內(nèi)形成了顆粒,并聚集在一起。2.在poly(I:C)刺激的細(xì)胞中,帶有標(biāo)簽的RHA N端和PKR N端均能在細(xì)胞中形成顆粒。3.在poly(I:C)刺激的細(xì)胞中,帶有標(biāo)簽的RHA N端和PKR N端形成的顆粒在胞質(zhì)內(nèi)共定位。4.在poly(I:C)刺激的細(xì)胞中,RHA和PKR與TIA-1均能全部共定位,而與G3BP1只能部分或不共定位。5.在沉默了PKR的細(xì)胞中,TIA-1,RHA和G3BP1形成的顆粒明顯下降;而沉默RHA的細(xì)胞中,只有TIA-1形成的顆粒明顯下降。結(jié)論:1.在ds RNA刺激的情況下,RHA與PKR能夠明顯的共定位。2.RHA N端和PKR N端在其形成顆粒及相互作用的過程中起著主要的作用。3.RHA,PKR和TIA-1在poly(I:C)刺激的細(xì)胞中形成的顆粒可能并不是經(jīng)典的SG。4.RHA,PKR和TIA-1的相互作用可能對于細(xì)胞有著其他重要的作用。綜上所述,本研究進(jìn)一步證實(shí)了RHA和PKR的相互作用,同時發(fā)現(xiàn)了其相互作用可能不僅僅局限于與SG的形成有關(guān),還可能與細(xì)胞其他的生理機(jī)制有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：MDA5 CCCP SG 自噬 RHA
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要3-7
• Abstract7-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-24
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法21-24
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-42
• 一、MDA5對CCCP誘導(dǎo)的自噬和應(yīng)激顆粒的調(diào)控的研究24-33
• 1 MDA5的沉默減弱CCCP誘導(dǎo)形成的SG24-26
• 2 MDA5在eIF2α 的下游調(diào)控CCCP誘導(dǎo)形成SG26-27
• 3 MDA5不是CCCP誘導(dǎo)的SG的組成成分27-28
• 4 MDA5的沉默下調(diào)CCCP誘導(dǎo)的自噬28-29
• 5 CCCP誘導(dǎo)的自噬依賴于SG的組分G3BP129-31
• 6 討論31-33
• 二、RHA參與細(xì)胞顆粒形成的研究33-42
• 1 免疫熒光驗(yàn)證RHA與PKR的相互作用33-34
• 2 RHA的N端和PKR的N端在兩者募集入細(xì)胞顆粒中起著重要作用34-36
• 3 RHA，PKR和TIA-1 聚集于dsRNA誘導(dǎo)的細(xì)胞顆粒中36-38
• 4 RHA，PKR形成的細(xì)胞顆粒作用是不同的38-40
• 5 討論40-42
• 創(chuàng)新性42
• 研究展望42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 縮略語表47-49
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表和待發(fā)表的論文49-50
• 致謝50

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