本文關鍵詞：多房棘球絳蟲HSP20蛋白的生物信息學分析、重組表達及泡球蚴的體外培養(yǎng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：利用生物信息學方法對多房棘球絳蟲熱休克蛋白20(EmHSP20)的結構和功能進行預測分析,并在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達EmHSP20重組蛋白。方法：利用多種生物信息學軟件對EmHSP20的結構和功能進行預測分析。將多房棘球絳蟲HSP20編碼序列整合到pET-28b(+)載體質粒上,然后轉化入DH5a菌株,雙酶切和測序鑒定重組質粒,然后將其轉化入Rosetta(DE3)表達菌株,經(jīng)誘導表達后用鎳柱純化,Western Blot鑒定重組蛋白并進行純度分析和濃度測定。結果：EmHSP20基因全長1261bp,編碼序列長945bp,編碼314個氨基酸,理論相對分子質量為35843.7Da,等電點為5.92。EmHSP20無信號肽,無跨膜區(qū),屬胞內蛋白。EmHSP20含有典型的兩個α-晶體結構域；富含4種類型的蛋白質功能位點,主要是磷酸化位點,說明磷酸化是其重要的翻譯后修飾；含有8個蛋白質結合位點,可與多種蛋白質相結合。成功構建了EmHSP20重組質粒及原核表達體系,經(jīng)Western Blot鑒定所得蛋白確為HSP20, SDS-PAGE分析顯示蛋白純度較高,測定濃度為1.1mg/mL。結論：通過生物信息學方法獲得了EmHSP20的基本信息,成功構建了EmHSP20重組子,并利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)高效表達了EmHSP20,為進一步研究其免疫保護力及生物學功能奠定了基礎。目的:用不同血清和培養(yǎng)基體外培養(yǎng)泡球蚴,以尋找更適合泡球蚴生長的體外培養(yǎng)條件。方法:分別采用DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和脂牛血清、小鼠血清、馬血清不同條件體外培養(yǎng)泡球蚴,記錄其生長情況并觀察囊泡形態(tài)和超微結構,尋找更適合泡球蚴生長的體外培養(yǎng)條件。結果：經(jīng)不同條件體外培養(yǎng)泡球蚴,發(fā)現(xiàn)DMEM-小鼠血清的培養(yǎng)條件下泡球蜘生長速度最快,囊泡數(shù)達34個,DMEM-胎牛血清培養(yǎng)條件下囊泡數(shù)為26個,RPMI1640-小鼠血清13個,RPMI1640-胎牛血清9個,而DMEM-馬血清和RPMI1640-馬血清的條件下無囊泡生長。小鼠血清培養(yǎng)的裹泡體積整體較胎牛血清培養(yǎng)的竇泡體積偏小。透射電鏡觀察四種囊泡超微結構無差異。結論:體外培養(yǎng)結果顯示,小鼠血清比常規(guī)使用的胎牛血清、馬血清更適合泡球蚴生長,DMEM比RPMI1640更造合泡球蚴生長。
【關鍵詞】：多房棘球絳蟲 熱休克蛋白20 生物信息學 泡球蚴 體外培養(yǎng)
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R383.3
【目錄】：

• 第一部分 多房棘球絳蟲HSP20蛋白的生物信息學分析與重組表達6-50
• 中文摘要6-7
• Abstract7-9
• 引言9-12
• 第一章 多房棘球絳蟲HSP20蛋白的生物信息學分析12-28
• 1.1 材料12
• 1.2 方法12
• 1.2.1 尋找EmHSP20的開放閱讀框12
• 1.2.2 EmHSP20氨基酸序列的生物信息學分析12
• 1.3 結果12-28
• 1.3.1 EmHSP20的開放閱讀框及編碼氨基酸12-13
• 1.3.2 EmHSP20氨基酸序列的blastp分析13-14
• 1.3.3 EmHSP20蛋白的理化性質及疏水性分析14-16
• 1.3.4 EmHSP20的跨膜區(qū)預測16
• 1.3.5 EmHSP20的信號肽及亞細胞定位預測16-17
• 1.3.6 EmHSP20 B細胞線性表位的預測17-18
• 1.3.7 EmHSP20的二級結構分析18-23
• 1.3.8 EmHSP20的保守結構域分析23
• 1.3.9 EmHSP20的三維結構預測23-24
• 1.3.10 EmHSP20同源性分析及分子進化樹的構建24-28
• 第二章 多房棘球絳蟲HSP20蛋白的重組表達28-44
• 2.1 材料28-32
• 2.1.1 質粒和菌株28
• 2.1.2 主要試劑28
• 2.1.3 主要實驗儀器和設備28-29
• 2.1.4 主要溶液的配制29-32
• 2.2 方法32-37
• 2.2.1 重組質粒的構建32-34
• 2.2.2 重組蛋白的原核表達34-36
• 2.2.3 重組蛋白的純化36
• 2.2.4 純化后蛋白的分析36-37
• 2.3 結果37-44
• 2.3.1 EmHSP20-pET-28b(+)重組質粒的雙酶切鑒定37-38
• 2.3.2 重組質粒插入片段的測序鑒定38-40
• 2.3.3 EmHSP20重組蛋白在Rosetta(DE3)中的表達及定位40-41
• 2.3.4 梯度洗脫液的SDS-PAGE分析41-42
• 2.3.5 重組蛋白的Western Blot分析42
• 2.3.6 重組蛋白的SDS-PAGE純度分析42-43
• 2.3.7 重組蛋白的濃度測定43-44
• 討論44-49
• 結論49-50
• 第二部分 泡球蚴的體外培養(yǎng)50-65
• 中文摘要50-51
• Abstract51-52
• 引言52-54
• 材料與方法54-59
• 1.1 材料54-56
• 1.1.1 泡球蚴54
• 1.1.2 人肝癌細胞株HepG254
• 1.1.3 主要試劑54
• 1.1.4 主要實驗儀器和設備54-55
• 1.1.5 主要溶液的配制55-56
• 1.2 方法56-59
• 1.2.1 肝癌細胞HepG2的培養(yǎng)56-57
• 1.2.2 泡球蚴的體外培養(yǎng)57-59
• 結果59-63
• 2.1 泡球蚴生長曲線59-60
• 2.2 光學顯微鏡下的囊泡形態(tài)60-62
• 2.3 囊泡超微結構的觀察62-63
• 討論63-64
• 結論64-65
• 參考文獻65-69
• 在學期間的研究成果69-70
• 致謝70-71
• 英文縮略語表71-72

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 曾紅春;大鼠肝泡狀棘球蚴多模態(tài)影像學的動態(tài)觀察與分析[D];新疆醫(yī)科大學;2013年

  本文關鍵詞：多房棘球絳蟲HSP20蛋白的生物信息學分析、重組表達及泡球蚴的體外培養(yǎng)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：266666