【摘要】：研究目的:研究膽道閉鎖(BA)患兒及小鼠模型中ROR-γt基因乙酰化水平表達(dá)及作用;探索TNFα-TNFRs信號調(diào)控ROR-γt基因乙�；降姆肿訖C(jī)制,并通過動物干預(yù)實驗注射TNFR1和TNFR2抗體,驗證TNFα-TNFR2通過調(diào)控ROR-γt基因表達(dá),促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、介導(dǎo)膽管炎性損傷。研究方法:2016年10月至2018年12月期間,59例就診于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院小兒外科的膽道閉鎖患兒,于行肝門空腸吻合術(shù)(Kasai術(shù))時留取肝臟組織;同期收取42例膽總管囊腫患兒肝臟組織作為對照組。新生Balb/c小鼠注射輪狀病毒(Rhesus Rotavirus,RRV)建立膽道閉鎖動物模型。將新生小鼠隨機(jī)分為四組:(1)RRV組:小鼠出生后于12小時內(nèi)腹腔注射20μL 1×105pfu RRV建立膽道閉鎖模型;(2)對照組:新生小鼠出生后12小時內(nèi)腹腔注射等量生理鹽水作為對照;(3)TNFR1干預(yù)組:新生小鼠出生后12小時內(nèi)腹腔注射20μL 1×105pfu RRV,其后每天注射TNFR1抗體(10μg/只)直至出生后7天;(4)TNFR2干預(yù)組:新生小鼠出生后12小時內(nèi)腹腔注射20μL 1×105 pfu RRV,其后每天注射TNFR2抗體(10μg/只)直至出生后7天;(5)TNFα干預(yù)組:新生小鼠出生后12小時內(nèi)腹腔注射20μL1×105 pfu RRV,其后每天注射TNFα抗體直至出生后7天。第一部分:取BA患兒和對照組肝臟組織,通過RT-q PCR、western blot測定、比較兩組ROR-γt表達(dá)水平;并利用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)檢測法檢測兩組中ROR-γt基因啟動子區(qū)乙酰化水平。分別留取小鼠RRV組和對照組第3天、第7天和第14天肝臟組織,檢測兩組ROR-γt表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)測定兩組Th17細(xì)胞數(shù)量及比例,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平;Ch IP法檢測比較兩組小鼠ROR-γt基因啟動子區(qū)乙�；�。第二部分:取BA患兒及對照組肝臟組織,以及小鼠RRV組和對照組第3天、第7天和第14天肝臟組織,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測兩組肝臟組織中TNFα表達(dá)水平;免疫組織化學(xué)染色法檢測肝臟組織中TNFR1和TNFR2的表達(dá)情況;通過RT-q PCR、western blot測定、比較兩組p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表達(dá)水平。第三部分:觀察小鼠RRV組、對照組、TNFR1、TNFR2和TNFα干預(yù)組五組小鼠體重變化、生存率、膽道閉鎖表型和肝臟組織病理情況;分別留取各組小鼠第3天、第7天和第14天肝臟組織,RT-q PCR和Western blot等方法檢測各組ROR-γt表達(dá)水平以及p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表達(dá)水平;Ch IP法檢測比較各組小鼠ROR-γt基因啟動子區(qū)乙�；�;流式細(xì)胞術(shù)測定各組Th17細(xì)胞數(shù)量及比例。實驗結(jié)果:第一部分:BA患兒和小鼠模型較之于相應(yīng)對照組比較,ROR-γt基因啟動子區(qū)乙�；斤@著升高(p0.001),ROR-γt表達(dá)量明顯升高(p0.01),Th17細(xì)胞分化增多,IL-17A分泌增多(p0.001);且BA小鼠模型中,ROR-γt基因啟動子區(qū)乙酰化水平和蛋白表達(dá)量隨時間增長,于第7天達(dá)到峰值,與Th17細(xì)胞增殖和相關(guān)細(xì)胞因子上調(diào)趨勢一致。第二部分:BA患兒肝臟組織中TNFα表達(dá)較對照組未見明顯升高,但免疫組織化學(xué)染色顯示TNFR1和TNFR2表達(dá)均增多,TNFR2表達(dá)顯著上調(diào)(p0.01),肝臟組織匯管區(qū)局部大量炎性細(xì)胞浸潤;小鼠RRV組較對照組相比,各個時間點TNFα表達(dá)均顯著升高(p0.05),TNFR1和TNFR2表達(dá)也均增多,且TNFR2增多更為顯著(p0.01),肝臟組織匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤。BA患兒和小鼠RRV組肝臟組織中p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65表達(dá)較相應(yīng)對照組均顯著升高(p0.01)。第三部分:TNFRs干預(yù)組小鼠與RRV組相比,均有不同程度的膽道閉鎖發(fā)生率降低、表型減輕,生存率提高,且與TNFR1干預(yù)組比較,TNFR2和TNFα干預(yù)組治療效果更顯著;此外,TNFR2和TNFα干預(yù)組中,p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表達(dá)水平較RRV組顯著下降(p0.01),且ROR-γt蛋白表達(dá)和基因啟動子區(qū)乙�；捷^RRV組也明顯下降(p0.001),Th17細(xì)胞比例減少(p0.001);而TNFR1干預(yù)組中p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表達(dá)和ROR-γt基因乙酰化水平與RRV組未見明顯差別。實驗結(jié)論:1.BA患兒及小鼠模型肝臟組織中,ROR-γt基因啟動子區(qū)乙酰化水平顯著升高,ROR-γt表達(dá)增高,Th17細(xì)胞分化、增殖增多,IL-17A分泌顯著增多;2.BA患兒及小鼠模型肝臟組織中,TNFα-TNFRs表達(dá)升高,上調(diào)下游NF-κB和MAPK-STAT3分子通路,促進(jìn)ROR-γt基因乙酰化水平增高;3.阻斷TNFα-TNFR2信號后,下游NF-κB和MAPK-STAT3表達(dá)顯著減少,ROR-γt基因啟動子區(qū)乙�；浇档�,Th17細(xì)胞表達(dá)減少,小鼠膽道閉鎖發(fā)生率降低、表型減輕,生存率提高。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文結(jié)果、膽道閉鎖患兒及小鼠模型中ROR-γt基因乙�；斤@著上調(diào)為研究膽道閉鎖疾病過程中ROR-γt基因表達(dá)調(diào)控水平，我們利用ChIP法檢測了閉鎖患兒及小鼠模型中ROR-γt基因啟動子區(qū)域乙酰化水平。結(jié)果表明，膽道閉鎖和小鼠模型肝臟組織中ROR-γt基因啟動子區(qū)乙�；捷^相應(yīng)對照組顯著升高。，膽道閉鎖小鼠模型中，ROR-γt基因啟動子區(qū)乙酰化水平隨時間增長逐漸增高，7天達(dá)到峰值。

38圖 1.2 膽道閉鎖小鼠與對照組ROR-γt 基因乙酰化水平比較：RRV 組中ROR-γt 基因啟動子區(qū)組蛋白H3和H4的乙�；骄^對照組顯著升高；且隨時間增長，，ROR-γt 乙�；街饾u增高
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R726.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 鐘浩宇;劉雪來;黃格元;;關(guān)于膽道閉鎖Kasai手術(shù)的若干問題[J];臨床小兒外科雜志;2016年01期

本文編號：2667210