【摘要】：梅毒是由密螺旋體蒼白亞種(Treponema pallidum subsp.Pallidum,T.pallidum,Tp)感染引起的多器官系統(tǒng)損害的慢性傳染病。據(jù)WHO估計(jì),每年Tp新發(fā)病例超過1200萬,且感染晚期癥狀嚴(yán)重,治療效果不佳,因此,在Tp高危人群中進(jìn)行有效的疫苗接種和早期預(yù)防對Tp防控具有重要意義。我們前期研究證實(shí)鞭毛蛋白FlaB3具有良好的免疫原性和致炎作用,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建Tp鞭毛蛋白pcDNA3/FlaB3真核載體,初步探索其免疫保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白DNA疫苗(pcDNA3/FlaB3)能誘導(dǎo)高水平的特異性抗體產(chǎn)生和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng),并且可減輕Tp感染部位皮損癥狀,抑制其向遠(yuǎn)端器官組織擴(kuò)散。由于DNA疫苗免疫原性較弱,誘導(dǎo)引起的免疫應(yīng)答強(qiáng)度和免疫效果也不穩(wěn)定,而佐劑的使用可以有效解決這一問題。因此選用免疫遺傳操作更方便的C57BL/6小鼠作為Tp感染動物模型來評估CpG佐劑增強(qiáng)DNA疫苗的抗感染免疫效果。將兩段CpG序列串聯(lián)插入pcDNA3/FlaB3構(gòu)建pcDNA3/CpG-FlaB3,在C57BL/6小鼠體內(nèi)評估CpG改良的DNA疫苗與pcDNA3/FlaB3疫苗的免疫應(yīng)答和抗感染保護(hù)的差異性,進(jìn)一步對pcDNA3/CpG-FlaB3的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行評價(jià)。本研究為Tp防控及疫苗研發(fā)提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Ⅰ梅毒螺旋體鞭毛蛋白DNA疫苗(pcDNA3/FlaB3)在新西蘭兔中抗感染免疫保護(hù)作用研究目的:評估Tp鞭毛蛋白(FlaB3)DNA疫苗(pcDNA3/FlaB3)免疫新西蘭兔后產(chǎn)生的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫以及減輕Tp感染部位皮損癥狀、抑制其向遠(yuǎn)端器官組織擴(kuò)散的免疫保護(hù)性作用。為研制預(yù)防和治療抗Tp感染的DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:1.鞭毛蛋白FlaB3基因亞克隆到pcDNA3.1構(gòu)建pcDNA3/FlaB3;利用脂質(zhì)體將pcDNA3/FlaB3轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,Western blot鑒定其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);2.pcDNA3/FlaB3肌肉注射雄性新西蘭兔的股四頭肌(每間隔2 w免疫一次,共免疫3次),注射劑量為重組鞭毛蛋白FlaB3(150μg)或pcDNA3/FlaB3(250μg);3.每次免疫后耳緣靜脈收集血清標(biāo)本,間接ELISA法檢測新西蘭兔血清中IgG抗體水平;4.ELISA試劑盒檢測新西蘭兔血清中IFN-γ、CD8~+T細(xì)胞、IL-6和IL-8的含量;5.末次免疫21 d后,背部皮膚(8個(gè)點(diǎn))皮內(nèi)注射1×10~7個(gè)Tp,每天觀察感染部位的皮疹、硬結(jié)和潰瘍,每隔三天測量皮損的直徑,記錄皮損出現(xiàn)的時(shí)間、大小和潰瘍率;6.感染21 d后,麻醉處死新西蘭兔,收集皮膚潰瘍部位的分泌液,暗視野顯微鏡記錄Tp載量;7.收集感染后新西蘭兔的血液、肝臟、脾臟、睪丸組織,提取組織DNA,RT-PCR檢測各組織內(nèi)Tp載量,并對各實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔皮損和睪丸組織作病理切片分析炎癥浸潤情況。結(jié)果:1.成功構(gòu)建真核質(zhì)粒pcDNA3/FlaB3,PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小(858 bp)一致的明顯條帶,Western blot顯示在34 kDa處有特異的的免疫反應(yīng)性條帶,而空質(zhì)粒組(pcDNA3.1)和對照組并未見明顯的免疫反應(yīng)性條帶;2.pcDNA3/FlaB3免疫后第2 w即產(chǎn)生鞭毛蛋白特異性抗體,隨后抗體水平逐漸增加,第8 w達(dá)到最大;3.pcDNA3/FlaB3免疫新西蘭兔血清中IFN-γ和CD8~+T細(xì)胞的含量明顯增加(P0.01);同時(shí),pcDNA3/FlaB3促進(jìn)新西蘭兔血清中炎癥因子(IL-6和IL-8)的分泌;4.各實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔的感染部位在第14 d全部出現(xiàn)皮膚損傷(硬結(jié)或潰瘍),但對照組免疫的新西蘭兔感染部位在第6~8 d即出現(xiàn)皮膚的硬結(jié)(100%),而pcDNA3/FlaB3免疫的新西蘭兔直到第11~12 d才達(dá)到同等程度的皮膚硬結(jié);對照組免疫的新西蘭兔在第14 d就出現(xiàn)感染部位的潰瘍,而pcDNA3/FlaB3免疫的新西蘭兔到第16 d才出現(xiàn)感染部位的潰瘍,且皮疹潰瘍率明顯低于對照組;同時(shí)也觀察到整個(gè)感染期間,pcDNA3/FlaB3免疫的新西蘭兔感染部位皮損直徑大小明顯小于對照組,且對照組新西蘭兔皮疹增長速度也明顯大于實(shí)驗(yàn)組(pcDNA3/FlaB3);暗視野顯微鏡觀察pcDNA3/FlaB3免疫的新西蘭兔感染部位皮疹活的Tp載量明顯少于對照組,而RT-PCR結(jié)果顯示pcDNA3/FlaB3免疫的新西蘭兔感染部位Tp的載量明顯多于對照組,與此相反的是,pcDNA3/FlaB3免疫新西蘭兔的肝臟、脾臟、血液、睪丸組織中的Tp載量明顯少于對照組(P0.05);5.pcDNA3/FlaB3免疫新西蘭兔感染部位的皮膚病理切片中毛囊孔周圍出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(主要包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞);而對照組免疫的新西蘭兔的睪丸間質(zhì)也出現(xiàn)大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)論:1.肌肉注射pcDNA3/FlaB3到新西蘭兔體內(nèi)可誘導(dǎo)高水平的特異性鞭毛蛋白抗體和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng);2.pcDNA3/FlaB3免疫新西蘭兔可延緩感染部位皮損發(fā)展,減輕皮損癥狀并抑制向肝臟、脾臟和睪丸等遠(yuǎn)端器官擴(kuò)散。ⅡCpG改良的梅毒螺旋體鞭毛蛋白DNA疫苗在C57BL/6小鼠中抗感染免疫保護(hù)作用研究目的:探索Tp感染的新型動物模型,在上述研究基礎(chǔ)上構(gòu)建CpG ODN改良的鞭毛蛋白(Fla B3)DNA疫苗(pc DNA3/CpG-Fla B3)免疫C57BL/6小鼠,分析其可能的免疫應(yīng)答機(jī)制和免疫保護(hù)作用,為研制預(yù)防和治療抗Tp感染的DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:1.將兩段CpG ODN序列串聯(lián)插入到pcDNA3/FlaB3,構(gòu)建pc DNA3/CpG-Fla B3。同法將pc DNA3/CpG-Fla B3轉(zhuǎn)染到He La細(xì)胞中,Western blot鑒定其在真核細(xì)胞中的表達(dá);2.肌肉注射到C57BL/6小鼠體內(nèi),每隔2 w免疫一次,共免疫3次。每次免疫后尾部靜脈收集血清標(biāo)本,間接ELISA法檢測C57BL/6小鼠血清中Ig G抗體反應(yīng)。末次免疫14 d后收集脾淋巴細(xì)胞,CCK8法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖情況;3.流式細(xì)胞術(shù)分析pc DNA3/CpG-Fla B3免疫C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞內(nèi)T淋巴細(xì)胞表型。ELISA試劑盒檢測各實(shí)驗(yàn)組C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10)表達(dá)水平;4.末次免疫14 d后,C57BL/6小鼠在皮下(兩側(cè)肩胛骨之間)、腹腔和直腸(灌胃)和陰莖海綿體4個(gè)部位感染Tp,每個(gè)部位的菌液量2.5×106(共1×107)個(gè)。每天觀察和評估C57BL/6小鼠皮膚和全身系統(tǒng)感染情況;5.感染30 d后,麻醉脫頸處死C57BL/6小鼠,收集小鼠血液、睪丸、淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腦組織,RT-PCR和免疫組織化學(xué)檢測各器官組織內(nèi)的Tp載量。同時(shí)將C57BL/6小鼠(3只/組)腹股溝、臂叢和腋窩的淋巴結(jié)分別轉(zhuǎn)染到新西蘭兔睪丸內(nèi),每天觀察新西蘭兔睪丸炎癥變化,每隔一周進(jìn)行新西蘭兔血清學(xué)檢測(RPR和TPPA),9 w后麻醉處死新西蘭兔,暗視野顯微鏡和RT-PCR檢測睪丸組織Tp載量。結(jié)果:1.由上海生工生物工程有限公司成功構(gòu)建pc DNA3/CpG-Fla B3,菌液PCR鑒定出明顯的目的條帶,Western blot驗(yàn)證pc DNA3/CpG-Fla B3能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá);2.pcDNA3/FlaB3(50μg)混合不同濃度的CpG(1μg、10μg、50μg、100μg)免疫C57BL/6小鼠驗(yàn)證CpG的佐劑效應(yīng),隨著CpG濃度的增加,其抗體水平逐漸增加;3.末次免疫14 d后,pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于對照組,并且多參數(shù)細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)染色(ICS)顯示pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)的CD4+T細(xì)胞主要分泌IFN-γ,IL-4的分泌水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;4.pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10含量顯著增加;5.RT-PCR分析顯示pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠血液、淋巴、睪丸、肝臟、脾臟和腦組織內(nèi)Tp載量與對照組相比明顯減少,新西蘭兔的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示新西蘭兔睪丸內(nèi)接受pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠淋巴結(jié)更早出現(xiàn)Tp血清學(xué)反應(yīng)陽性,其睪丸內(nèi)的Tp載量也明顯多于對照組;6.免疫小鼠的睪丸、肝臟和脾臟免疫組織化學(xué)顯示對照組免疫的C57BL/6小鼠器官組織內(nèi)出現(xiàn)大量的Tp。結(jié)論:1.pc DNA3/CpG-Fla B3可誘導(dǎo)高水平的特異性鞭毛蛋白抗體產(chǎn)生和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答;2.pc DNA3/CpG-Fla B3增強(qiáng)免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值反應(yīng);3.CpG佐劑的新型免疫策略增強(qiáng)了梅毒螺旋體鞭毛蛋白(FlaB3)DNA疫苗的免疫保護(hù)性效果。
【圖文】：

圖 1.1 pcDNA3/FlaB3 的 PCR 擴(kuò)ification of pcDNA3/FlaB3. Lane 1A3/FLaB2 and pcDNA3/FLaB1 are shpcDNA3/FlaB3的菌液PCR鑒定核表達(dá)載體 pcDNA3/FlaB3 轉(zhuǎn)入 E.coR 和 FlaB3-F 為引物進(jìn)行菌液 PCR 鑒顯的目的條帶。

達(dá)載體pcDNA3/FlaB3的菌液PCR鑒定功的真核表達(dá)載體 pcDNA3/FlaB3 轉(zhuǎn)入 E.coil JM 10FlaB3-R 和 FlaB3-F 為引物進(jìn)行菌液 PCR 鑒定：從圖置有明顯的目的條帶。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R377.1

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