【摘要】：前言:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistance S.aureus,MRSA)簡稱金葡菌,是臨床常見的致病菌,可以引起多種感染性疾病。糖肽類抗生素萬古霉素是臨床治療MRSA感染最常用的抗生素,也被認為是控制嚴重MRSA感染的最后一道防線。然而,隨著萬古霉素的大量使用,臨床上萬古霉素低敏感性金葡菌的檢出率不斷提高,其中萬古霉素中介耐藥的金葡菌(vancomycin-intermediate S.aureus,VISA)和異質(zhì)性萬古霉素中介耐藥的金葡菌(heterogeneous VISA,hVISA)最為多見。普遍的觀點認為VISA/hVISA是萬古霉素敏感性金葡菌(vancomycin-sensitive Stahylococcus aureus,VSSA)或其部分子菌株在萬古霉素的壓力選擇作用下產(chǎn)生的適應(yīng)性耐藥。VISA會發(fā)生細胞壁厚度、溶血、自溶、生物膜形成等方面的表型改變,但VISA在蛋白層面的耐藥特征解析尚不充分�？股厝允悄壳爸委熂毦腥拘约膊∽钣行У乃幬�,然而,在抗生素的壓力選擇作用下越來越多的細菌出現(xiàn)了多重耐藥性,因此,尋求新的控制感染的方法變得更加迫切。目前,盡管對萬古霉素完全耐藥的金葡菌仍屬罕見,但低水平萬古霉素耐藥的金葡菌hVISA和VISA的檢出率仍然較高。免疫系統(tǒng)是機體對抗感染的重要武器。固有免疫系統(tǒng)能夠快速識別并清除進入體內(nèi)的病原體,是人體防御感染的第一道防線。巨噬細胞是機體的固有免疫細胞,能夠吞噬和清除進入細胞內(nèi)的病原體,并分泌多種生物活性物質(zhì),在機體的免疫防御中發(fā)揮重要作用。自噬是一種依賴溶酶體對細胞內(nèi)的蛋白和細胞器進行降解的分解代謝過程,不僅在細胞應(yīng)激過程中發(fā)揮有效的再循環(huán)作用,在抵御胞內(nèi)菌感染過程中也起著重要作用。研究顯示,巨噬細胞自噬在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,但一些胞內(nèi)菌和病毒可以通過干擾細胞自噬體成熟來促使自身在宿主細胞內(nèi)的存活。金葡菌最初被認為是一種胞外菌,但越來越多的研究表明其可以侵入宿主細胞,這可能是造成慢性持續(xù)性感染的重要原因。然而金葡菌在細胞內(nèi)的命運尚不完全清楚。臨床上VISA常常引起慢性持續(xù)性感染,這可能與VISA抵御宿主細胞對胞內(nèi)菌的清除作用有關(guān)。文獻報道VISA可以通過改變致病因子的表達逃避宿主細胞的免疫應(yīng)答以利于持續(xù)感染。然而,VISA菌株是否能夠通過調(diào)控宿主細胞的自噬過程逃避宿主細胞對其的清除目前尚無報道。因此,本研究選取臨床分離的VSSA菌株11,模擬臨床治療增加萬古霉素的用量,采用多步體外萬古霉素誘導(dǎo),得到萬古霉素最低抑菌濃度(minimal inhibitoryconcentration,MIC)升高的VISA菌株11Y,用菌株11Y和11分別感染RAW264.7巨噬細胞來探究二者在細胞內(nèi)存活、引起細胞自噬和炎癥反應(yīng)的情況以及他們調(diào)控RAW264.7細胞自噬和炎癥反應(yīng)的機制,并解析菌株11Y的耐藥特征。研究方法:1.MTT實驗檢測菌株11Y和11分別感染RAW264.7巨噬細胞后30min、1h、2h、4h細胞的活力。2.BHI瓊脂平板菌落計數(shù)法檢測細胞內(nèi)吞噬的菌株11Y和11的活力。3.透射電鏡觀察RAW264.7巨噬細胞內(nèi)吞噬的菌株11Y和11周圍的自噬代表性雙層膜狀結(jié)構(gòu)。4.激光共聚焦顯微鏡檢測菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細胞內(nèi)聚集成點狀的LC3-Ⅱ。5.Real-time PCR檢測菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細胞炎癥相關(guān)細胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達。6.ELISA檢測菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)上清中上述炎癥相關(guān)細胞因子的含量變化。7.熒光酶標儀檢測菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細胞內(nèi)的ROS含量。8.Western Blot檢測菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細胞內(nèi)NLRP3、mTOR/p-mTOR、LC3和SQSTM1的含量。9.用ROS抑制劑NAC清除菌株11Y和11感染后RAW264.7細胞產(chǎn)生的ROS,檢測上述指標的變化。10.透射電鏡觀察并測定菌株11Y和11的細胞壁厚度。11.血瓊脂平板測定菌株11Y和11的δ-溶血活性。12.可見光分光光度計測定菌株11Y和11的菌液吸光度值,判定自溶活性。13.結(jié)晶紫染色法檢測菌株11Y和11的生物膜形成能力。14.串聯(lián)質(zhì)譜標簽(TMT)標記菌株11Y和11的總蛋白,LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析差異表達蛋白。結(jié)果:1.菌株11Y和11感染RAW264.7巨噬細胞后均能夠引起細胞發(fā)生自噬和炎癥反應(yīng)。(1)透射電鏡結(jié)果顯示11Y和11在感染RAW264.7細胞后4h,二者在細胞內(nèi)的單個菌體周圍均有自噬代表性的雙層膜狀結(jié)構(gòu),然而在包裹多個菌體的囊泡周圍僅可見部分雙層膜狀結(jié)構(gòu)或者無雙層膜狀結(jié)構(gòu),說明11Y和11感染RAW264.7細胞后均能夠引起細胞自噬,隨著二者在細胞內(nèi)的分裂繁殖,細胞自噬受到抑制。(2)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示11Y和11在感染RAW264.7細胞后的30min、1h、2h、4h,細胞內(nèi)均能觀察到聚集成點狀的LC3-Ⅱ,說明二者感染RAW264.7細胞后均能夠引起細胞發(fā)生自噬。(3)Real-time PCR結(jié)果顯示11Y和11感染RAW264.7細胞后30min、1h、2h、4h,細胞IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達量均顯著升高,其升高程度與感染時間呈正相關(guān),11Y與11感染組之間無顯著性差異,而IFN-γ的表達量無顯著變化。ELISA結(jié)果顯示上述炎癥相關(guān)細胞因子的蛋白表達水平與Real-time PCR結(jié)果基本一致。說明11Y和11感染RAW264.7細胞后均能夠引起炎癥反應(yīng),二者引起的炎癥反應(yīng)程度無顯著差別。2.菌株11Y和11通過ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7細胞自噬。(1)Western Blot結(jié)果顯示11Y和11感染RAW264.7細胞后30min、1h、2h、4h,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達均升高,11Y感染后各個時間點細胞LC3-Ⅱ的表達量均比11感染組高。菌株11Y感染細胞后30min,SQSTM1的表達先降低,隨后升高至與對照組相當(dāng)?shù)乃?而菌株11感染細胞后各個時間點SQSTM1的表達量均降低。說明菌株11感染引起RAW264.7細胞發(fā)生自噬的自噬流通暢,而11Y感染引起的細胞自噬上游反應(yīng)正常,下游自噬小體與溶酶體融合障礙。(2)菌株11Y和11均能引起RAW264.7細胞內(nèi)NLRP3、p-mTOR含量升高,11Y感染后NLRP3、p-mTOR升高更多。熒光酶標儀檢測結(jié)果顯示11Y和11均能夠引起RAW264.7細胞內(nèi)ROS含量升高,二者感染后30min、1h、2h、4h細胞內(nèi)的ROS含量無顯著差別。說明11Y和11均可能通過ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7細胞自噬。(3)菌株11Y和11感染NAC預(yù)處理24h的RAW264.7細胞后1h,細胞的NLRP3、p-mTOR、SQSTM1蛋白表達較NAC未處理組顯著降低,LC3-Ⅱ蛋白表達較NAC未處理組顯著升高,菌株11感染組上述指標變化更顯著,進一步證實了菌株11Y和11均通過ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7細胞自噬。3.菌株11Y在RAW264.7細胞內(nèi)的存活能力增強,NAC對感染菌株11的細胞保護作用強,對感染11Y的細胞保護作用較弱。(1)BHI瓊脂平板菌落計數(shù)結(jié)果顯示菌株11Y和11在以感染復(fù)數(shù)MOI=25感染RAW264.7細胞后,在感染后30min、1h、2h、4h菌株11Y在細胞內(nèi)的存活數(shù)量均比菌株11高10倍,說明11Y在RAW264.7細胞內(nèi)的存活能力更強。NAC預(yù)處理24h的RAW264.7細胞幾乎可以清除掉全部細胞內(nèi)存活的菌株11,而只能清除掉部分細胞內(nèi)存活的11Y,其數(shù)量比NAC未處理組下降了10倍,說明NAC對感染菌株11的細胞保護作用更強。(2)Real-time PCR結(jié)果顯示,NAC預(yù)處理后11Y和11感染的RAW264.7細胞在30min、1h、2h、4h炎癥相關(guān)細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達均顯著降低,11感染組比11Y感染組上述細胞因子表達量下降更多。ELISA結(jié)果顯示上述炎癥相關(guān)細胞因子的蛋白表達水平與Real-time PCR結(jié)果基本一致。說明NAC可以顯著降低11Y和11感染RAW264.7細胞引起的炎癥反應(yīng),進一步印證了NAC對感染菌株11的細胞保護作用更強。4.菌株11Y與11相比,11Y耐藥相關(guān)表型和蛋白質(zhì)表達均存在差異。(1)透射電鏡結(jié)果顯示11Y的細胞壁明顯增厚;δ-溶血實驗結(jié)果顯示11Y與菌株RN4420交界面無溶血增強區(qū)出現(xiàn),δ-溶血活性消失;自溶實驗結(jié)果顯示不同檢測時間點11Y的吸光度值均顯著高于11,自溶活性下降;生物膜形成實驗結(jié)果顯示11Y的生物膜形成減少,說明VISA菌株11Y與VSSA菌株11耐藥相關(guān)表型存在差異,致病性降低。(2)TMT LC-MS/MS蛋白質(zhì)組串聯(lián)分析結(jié)果顯示菌株11Y與耐藥相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白表達升高。11Y中表達量高于2.0倍的蛋白質(zhì)共128個,低于0.5倍的蛋白質(zhì)共21個。京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)聚類分析結(jié)果顯示,這些差異表達的蛋白質(zhì)主要分布在碳代謝、RNA降解、三羧酸循環(huán)、RNA合成、核糖體、嘧啶代謝、硫轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、肽聚糖合成、賴氨酸代謝、金葡菌感染和ABC轉(zhuǎn)運等途徑。說明11Y與11相比,耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)表達存在差異,這些差異表達的蛋白質(zhì)存在于細菌代謝和感染的多個途徑。結(jié)論:1.菌株11Y和11感染RAW264.7巨噬細胞后均能夠引起自噬和炎癥反應(yīng),11Y引起的自噬嚴重不足,二者引起的炎癥反應(yīng)無顯著差異。2.菌株11Y和11通過ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7巨噬細胞自噬。3.菌株11Y和11的耐藥相關(guān)表型和蛋白質(zhì)表達存在顯著差異。
【圖文】：

（ANOVA）對上述實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。所有結(jié)果均以三次獨立實驗的均數(shù)±標準差（x±S）表示，p<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 菌株 11Y 和 11 對 RAW264.7 細胞活力的影響為了選擇細菌感染細胞的最適 MOI，我們用 MTT 實驗檢測了菌株 11Y 和 11 感染 RAW264.7 細胞后不同時間點 RAW264.7 細胞的活力。結(jié)果顯示，當(dāng)菌株 11Y 和11 感染細胞的 MOI≤25 時，MOI 值越小，細胞的存活率越高，當(dāng) MOI＞25 時，感染細胞后不同時間點細菌的分裂繁殖對細胞的影響較大（圖 3.1）。因此本實驗選擇 MOI=25 作為菌株 11Y 和 11 感染 RAW264.7 細胞的 MOI，并且在后續(xù)的所有感染實驗中均選擇 MOI=25 作為感染復(fù)數(shù)。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文.2 RAW264.7 巨噬細胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 活力測定為了檢測 RAW264.7 細胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 的活力變化，我們用 BHI平板菌落計數(shù)方法檢測了細胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 的活菌數(shù)量，結(jié)果顯AW264.7 細胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 的活菌數(shù)量均在感染后 30min 最高，1h，，隨后逐漸升高，4h 幾乎升高到與 30min 相當(dāng)?shù)乃�。在感染后的各個時間點株 11Y 在 RAW264.7 細胞內(nèi)的活力均比菌株 11 高 10 倍（圖 3.2）。說明菌株 1 11 感染 RAW264.7 細胞后均能夠在細胞內(nèi)存活，且菌株 11Y 的存活能力更強著感染時間的延長，RAW264.7 細胞能夠清除掉部分進入細胞內(nèi)的細菌，但隨株 11Y 和 11 在感染細胞內(nèi)的分裂繁殖，二者能夠逃避 RAW264.7 細胞的清除。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378

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1 仲建春;杜q

本文編號：2664595