【摘要】：前言:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistance S.aureus,MRSA)簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌,是臨床常見(jiàn)的致病菌,可以引起多種感染性疾病。糖肽類(lèi)抗生素萬(wàn)古霉素是臨床治療MRSA感染最常用的抗生素,也被認(rèn)為是控制嚴(yán)重MRSA感染的最后一道防線(xiàn)。然而,隨著萬(wàn)古霉素的大量使用,臨床上萬(wàn)古霉素低敏感性金葡菌的檢出率不斷提高,其中萬(wàn)古霉素中介耐藥的金葡菌(vancomycin-intermediate S.aureus,VISA)和異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介耐藥的金葡菌(heterogeneous VISA,hVISA)最為多見(jiàn)。普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為VISA/hVISA是萬(wàn)古霉素敏感性金葡菌(vancomycin-sensitive Stahylococcus aureus,VSSA)或其部分子菌株在萬(wàn)古霉素的壓力選擇作用下產(chǎn)生的適應(yīng)性耐藥。VISA會(huì)發(fā)生細(xì)胞壁厚度、溶血、自溶、生物膜形成等方面的表型改變,但VISA在蛋白層面的耐藥特征解析尚不充分�？股厝允悄壳爸委熂�(xì)菌感染性疾病最有效的藥物,然而,在抗生素的壓力選擇作用下越來(lái)越多的細(xì)菌出現(xiàn)了多重耐藥性,因此,尋求新的控制感染的方法變得更加迫切。目前,盡管對(duì)萬(wàn)古霉素完全耐藥的金葡菌仍屬罕見(jiàn),但低水平萬(wàn)古霉素耐藥的金葡菌hVISA和VISA的檢出率仍然較高。免疫系統(tǒng)是機(jī)體對(duì)抗感染的重要武器。固有免疫系統(tǒng)能夠快速識(shí)別并清除進(jìn)入體內(nèi)的病原體,是人體防御感染的第一道防線(xiàn)。巨噬細(xì)胞是機(jī)體的固有免疫細(xì)胞,能夠吞噬和清除進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病原體,并分泌多種生物活性物質(zhì),在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮重要作用。自噬是一種依賴(lài)溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的分解代謝過(guò)程,不僅在細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮有效的再循環(huán)作用,在抵御胞內(nèi)菌感染過(guò)程中也起著重要作用。研究顯示,巨噬細(xì)胞自噬在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,但一些胞內(nèi)菌和病毒可以通過(guò)干擾細(xì)胞自噬體成熟來(lái)促使自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活。金葡菌最初被認(rèn)為是一種胞外菌,但越來(lái)越多的研究表明其可以侵入宿主細(xì)胞,這可能是造成慢性持續(xù)性感染的重要原因。然而金葡菌在細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn)尚不完全清楚。臨床上VISA常常引起慢性持續(xù)性感染,這可能與VISA抵御宿主細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)菌的清除作用有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道VISA可以通過(guò)改變致病因子的表達(dá)逃避宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答以利于持續(xù)感染。然而,VISA菌株是否能夠通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞的自噬過(guò)程逃避宿主細(xì)胞對(duì)其的清除目前尚無(wú)報(bào)道。因此,本研究選取臨床分離的VSSA菌株11,模擬臨床治療增加萬(wàn)古霉素的用量,采用多步體外萬(wàn)古霉素誘導(dǎo),得到萬(wàn)古霉素最低抑菌濃度(minimal inhibitoryconcentration,MIC)升高的VISA菌株11Y,用菌株11Y和11分別感染RAW264.7巨噬細(xì)胞來(lái)探究二者在細(xì)胞內(nèi)存活、引起細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng)的情況以及他們調(diào)控RAW264.7細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng)的機(jī)制,并解析菌株11Y的耐藥特征。研究方法:1.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)菌株11Y和11分別感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后30min、1h、2h、4h細(xì)胞的活力。2.BHI瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)吞噬的菌株11Y和11的活力。3.透射電鏡觀察RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬的菌株11Y和11周?chē)淖允纱硇噪p層膜狀結(jié)構(gòu)。4.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)聚集成點(diǎn)狀的LC3-Ⅱ。5.Real-time PCR檢測(cè)菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)。6.ELISA檢測(cè)菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中上述炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的含量變化。7.熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。8.Western Blot檢測(cè)菌株11Y和11感染后RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3、mTOR/p-mTOR、LC3和SQSTM1的含量。9.用ROS抑制劑NAC清除菌株11Y和11感染后RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的ROS,檢測(cè)上述指標(biāo)的變化。10.透射電鏡觀察并測(cè)定菌株11Y和11的細(xì)胞壁厚度。11.血瓊脂平板測(cè)定菌株11Y和11的δ-溶血活性。12.可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定菌株11Y和11的菌液吸光度值,判定自溶活性。13.結(jié)晶紫染色法檢測(cè)菌株11Y和11的生物膜形成能力。14.串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)標(biāo)記菌株11Y和11的總蛋白,LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析差異表達(dá)蛋白。結(jié)果:1.菌株11Y和11感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后均能夠引起細(xì)胞發(fā)生自噬和炎癥反應(yīng)。(1)透射電鏡結(jié)果顯示11Y和11在感染RAW264.7細(xì)胞后4h,二者在細(xì)胞內(nèi)的單個(gè)菌體周?chē)凶允纱硇缘碾p層膜狀結(jié)構(gòu),然而在包裹多個(gè)菌體的囊泡周?chē)鷥H可見(jiàn)部分雙層膜狀結(jié)構(gòu)或者無(wú)雙層膜狀結(jié)構(gòu),說(shuō)明11Y和11感染RAW264.7細(xì)胞后均能夠引起細(xì)胞自噬,隨著二者在細(xì)胞內(nèi)的分裂繁殖,細(xì)胞自噬受到抑制。(2)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示11Y和11在感染RAW264.7細(xì)胞后的30min、1h、2h、4h,細(xì)胞內(nèi)均能觀察到聚集成點(diǎn)狀的LC3-Ⅱ,說(shuō)明二者感染RAW264.7細(xì)胞后均能夠引起細(xì)胞發(fā)生自噬。(3)Real-time PCR結(jié)果顯示11Y和11感染RAW264.7細(xì)胞后30min、1h、2h、4h,細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量均顯著升高,其升高程度與感染時(shí)間呈正相關(guān),11Y與11感染組之間無(wú)顯著性差異,而IFN-γ的表達(dá)量無(wú)顯著變化。ELISA結(jié)果顯示上述炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平與Real-time PCR結(jié)果基本一致。說(shuō)明11Y和11感染RAW264.7細(xì)胞后均能夠引起炎癥反應(yīng),二者引起的炎癥反應(yīng)程度無(wú)顯著差別。2.菌株11Y和11通過(guò)ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7細(xì)胞自噬。(1)Western Blot結(jié)果顯示11Y和11感染RAW264.7細(xì)胞后30min、1h、2h、4h,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)均升高,11Y感染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)量均比11感染組高。菌株11Y感染細(xì)胞后30min,SQSTM1的表達(dá)先降低,隨后升高至與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?而菌株11感染細(xì)胞后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SQSTM1的表達(dá)量均降低。說(shuō)明菌株11感染引起RAW264.7細(xì)胞發(fā)生自噬的自噬流通暢,而11Y感染引起的細(xì)胞自噬上游反應(yīng)正常,下游自噬小體與溶酶體融合障礙。(2)菌株11Y和11均能引起RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NLRP3、p-mTOR含量升高,11Y感染后NLRP3、p-mTOR升高更多。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示11Y和11均能夠引起RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高,二者感染后30min、1h、2h、4h細(xì)胞內(nèi)的ROS含量無(wú)顯著差別。說(shuō)明11Y和11均可能通過(guò)ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7細(xì)胞自噬。(3)菌株11Y和11感染NAC預(yù)處理24h的RAW264.7細(xì)胞后1h,細(xì)胞的NLRP3、p-mTOR、SQSTM1蛋白表達(dá)較NAC未處理組顯著降低,LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較NAC未處理組顯著升高,菌株11感染組上述指標(biāo)變化更顯著,進(jìn)一步證實(shí)了菌株11Y和11均通過(guò)ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7細(xì)胞自噬。3.菌株11Y在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的存活能力增強(qiáng),NAC對(duì)感染菌株11的細(xì)胞保護(hù)作用強(qiáng),對(duì)感染11Y的細(xì)胞保護(hù)作用較弱。(1)BHI瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示菌株11Y和11在以感染復(fù)數(shù)MOI=25感染RAW264.7細(xì)胞后,在感染后30min、1h、2h、4h菌株11Y在細(xì)胞內(nèi)的存活數(shù)量均比菌株11高10倍,說(shuō)明11Y在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的存活能力更強(qiáng)。NAC預(yù)處理24h的RAW264.7細(xì)胞幾乎可以清除掉全部細(xì)胞內(nèi)存活的菌株11,而只能清除掉部分細(xì)胞內(nèi)存活的11Y,其數(shù)量比NAC未處理組下降了10倍,說(shuō)明NAC對(duì)感染菌株11的細(xì)胞保護(hù)作用更強(qiáng)。(2)Real-time PCR結(jié)果顯示,NAC預(yù)處理后11Y和11感染的RAW264.7細(xì)胞在30min、1h、2h、4h炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)均顯著降低,11感染組比11Y感染組上述細(xì)胞因子表達(dá)量下降更多。ELISA結(jié)果顯示上述炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平與Real-time PCR結(jié)果基本一致。說(shuō)明NAC可以顯著降低11Y和11感染RAW264.7細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng),進(jìn)一步印證了NAC對(duì)感染菌株11的細(xì)胞保護(hù)作用更強(qiáng)。4.菌株11Y與11相比,11Y耐藥相關(guān)表型和蛋白質(zhì)表達(dá)均存在差異。(1)透射電鏡結(jié)果顯示11Y的細(xì)胞壁明顯增厚;δ-溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示11Y與菌株RN4420交界面無(wú)溶血增強(qiáng)區(qū)出現(xiàn),δ-溶血活性消失;自溶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)11Y的吸光度值均顯著高于11,自溶活性下降;生物膜形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示11Y的生物膜形成減少,說(shuō)明VISA菌株11Y與VSSA菌株11耐藥相關(guān)表型存在差異,致病性降低。(2)TMT LC-MS/MS蛋白質(zhì)組串聯(lián)分析結(jié)果顯示菌株11Y與耐藥相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白表達(dá)升高。11Y中表達(dá)量高于2.0倍的蛋白質(zhì)共128個(gè),低于0.5倍的蛋白質(zhì)共21個(gè)。京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要分布在碳代謝、RNA降解、三羧酸循環(huán)、RNA合成、核糖體、嘧啶代謝、硫轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、肽聚糖合成、賴(lài)氨酸代謝、金葡菌感染和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑。說(shuō)明11Y與11相比,耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異,這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)存在于細(xì)菌代謝和感染的多個(gè)途徑。結(jié)論:1.菌株11Y和11感染RAW264.7巨噬細(xì)胞后均能夠引起自噬和炎癥反應(yīng),11Y引起的自噬嚴(yán)重不足,二者引起的炎癥反應(yīng)無(wú)顯著差異。2.菌株11Y和11通過(guò)ROS/NLRP3/mTOR通路調(diào)控RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬。3.菌株11Y和11的耐藥相關(guān)表型和蛋白質(zhì)表達(dá)存在顯著差異。
【圖文】：

（ANOVA）對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有結(jié)果均以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，p<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 菌株 11Y 和 11 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響為了選擇細(xì)菌感染細(xì)胞的最適 MOI，我們用 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了菌株 11Y 和 11 感染 RAW264.7 細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn) RAW264.7 細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示，當(dāng)菌株 11Y 和11 感染細(xì)胞的 MOI≤25 時(shí)，MOI 值越小，細(xì)胞的存活率越高，當(dāng) MOI＞25 時(shí)，感染細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌的分裂繁殖對(duì)細(xì)胞的影響較大（圖 3.1）。因此本實(shí)驗(yàn)選擇 MOI=25 作為菌株 11Y 和 11 感染 RAW264.7 細(xì)胞的 MOI，并且在后續(xù)的所有感染實(shí)驗(yàn)中均選擇 MOI=25 作為感染復(fù)數(shù)。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文.2 RAW264.7 巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 活力測(cè)定為了檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 的活力變化，我們用 BHI平板菌落計(jì)數(shù)方法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 的活菌數(shù)量，結(jié)果顯AW264.7 細(xì)胞內(nèi)吞噬的菌株 11Y 和 11 的活菌數(shù)量均在感染后 30min 最高，1h，，隨后逐漸升高，4h 幾乎升高到與 30min 相當(dāng)?shù)乃�。在感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)株 11Y 在 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)的活力均比菌株 11 高 10 倍（圖 3.2）。說(shuō)明菌株 1 11 感染 RAW264.7 細(xì)胞后均能夠在細(xì)胞內(nèi)存活，且菌株 11Y 的存活能力更強(qiáng)著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，RAW264.7 細(xì)胞能夠清除掉部分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，但隨株 11Y 和 11 在感染細(xì)胞內(nèi)的分裂繁殖，二者能夠逃避 RAW264.7 細(xì)胞的清除。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2664595