發(fā)布時間：2020-05-13 16:50

【摘要】：肺動脈高壓(PAH)是肺血管阻力進(jìn)行性增加,肺動脈壓力持續(xù)增高,影響心肺功能和心輸出量,引起活動受限和壽命縮短的病理綜合征。目前的特異性靶向藥物治療能改善病情,但作用有限。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)聯(lián)合基因治療是未來的新方向。EPCs具有歸巢至血管損傷部位,分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞,形成血管等生物特性,同時也是具有促進(jìn)EPCs生理功能,表達(dá)有功能蛋白的基因的載體。二者共同作用以達(dá)到改善血管重塑的目的。本文以眾多的基因修飾EPCs的治療為參考,在野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中研究預(yù)防性靜脈注射人組織激肽釋放酶1(hTK1)基因轉(zhuǎn)染的同源EPCs對PAH的血流動力學(xué)、病理改變的影響。從而為PAH的細(xì)胞生物學(xué)治療提供一些科學(xué)依據(jù)。研究目的觀察靜脈注射轉(zhuǎn)染人組織激肽釋放酶(hTK1)基因的同源內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)對野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓(PAH)血流動力學(xué),血清一氧化氮(NO)水平和肺小動脈病理改變的影響。研究方法1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)密度梯度離心法分離提取雄性Wistar大鼠骨髓單個核細(xì)胞,EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng);(2)通過觀察細(xì)胞生長特性,吞噬紅色熒光標(biāo)記乙�；兔芏戎鞍�(Dil-acLDL)及結(jié)合異硫氰酸熒光素標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)的熒光檢測,鑒定骨髓源性單個核細(xì)胞(BMMNCs)為EPCs;(3)攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)梯度轉(zhuǎn)染EPCs,觀察細(xì)胞生長活性和熒光顯示情況,獲得該腺病毒對EPCs的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI);(4)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察攜帶hTK1基因的腺病毒(Ad-hTK1)轉(zhuǎn)染對EPCs增殖、遷移能力的影響;(5)檢測Ad-hTK1轉(zhuǎn)染EPCs細(xì)胞裂解液中一氧化氮(NO)含量;(6)Western blotting檢測Ad-hTK1轉(zhuǎn)染EPCs中人組織激肽釋放酶(hTK1)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達(dá)情況。2、動物實(shí)驗(yàn):(1)7-8周雄性Wistar大鼠30只隨機(jī)分為正常對照組6只(NC組),和1%MCT溶液腹腔注射建立的PAH模型組。模型組再隨機(jī)分為3組,每組8只,于MCT注射3天后分別頸靜脈注射磷酸鹽緩沖液(MCT+PBS組)、同源EPCs(MCT+EPCs組)或轉(zhuǎn)染hTK1基因的EPCs(MCT+Ad-hTK1-EPCs組),注射細(xì)胞數(shù)量約為106/次(以0.5ml PBS混勻),連續(xù)注射兩天;(2)實(shí)驗(yàn)前和造模2周、4周對四個動物組進(jìn)行心臟超聲檢查,動態(tài)監(jiān)測的超聲參數(shù)包括右室前壁厚度(RVAWT)、肺動脈內(nèi)徑(PAD)、主動脈內(nèi)徑(AOD)、肺、主動脈內(nèi)徑之比(PAD/AOD)、肺動脈加速時間(PAAT)、肺動脈射血時間(PAET)、肺動脈加速、射血時間之比(PAAT/PAET)、右室舒張末橫徑(RVEDD)、右室舒張末縱徑(RVEDL)、右室舒張末橫徑、縱徑之比(RVEDD/RVEDL)、三尖瓣環(huán)收縮期位移(TAPSE)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF);(3)檢測實(shí)驗(yàn)前和造模2周、4周四個組血清NO水平;(4)最后一次心臟超聲檢查后,右室置管測肺動脈壓,記錄肺動脈收縮壓(PASP)、肺動脈平均壓(PAMP)、右室壓力上升速率dp/dtmax和下降速率dp/dtmin;(5)右室測壓后取材心肺器官,測量右心室肥厚指數(shù)(RVHI),肺組織石蠟切片蘇木素-伊紅(HE)染色測量血管外徑100-200μm的肺小動脈管壁厚度指數(shù)(WT%)、管壁面積指數(shù)(WA%);(6)Western blotting檢測肺組織hTK1、eNOS蛋白表達(dá)情況;(7)Ad-GFP-EPCs靜脈移植入MCT腹腔注射7天后的兩只大鼠體內(nèi),2天后取材,冰凍切片觀察EPCs在心、肝、脾、肺、腎中分布情況。研究結(jié)果:1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)骨髓單個核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化,原代細(xì)胞4天貼壁,7天出現(xiàn)細(xì)胞集落,14-21天可傳代,傳代細(xì)胞仍可見細(xì)胞集落,3-7天傳代一次,隨著傳代次數(shù)增加,集落變小,逐漸消失,細(xì)胞增殖分化類似內(nèi)皮細(xì)胞;(2)Dil-acLDL、FITC-UEA-I雙陽性染色鑒定BMMNCs為正在分化的EPCs;(3)按MOI=0,25,50,100,150,200,250將Ad-GFP轉(zhuǎn)染入EPCs,在MOI=150時細(xì)胞熒光顯示最好,且細(xì)胞生長活性不受影響,因而確定最佳MOI=150;(4)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別顯示Ad-hTK1轉(zhuǎn)染EPCs(Ad-hTK1-EPCs)的吸光度值A(chǔ)450、劃痕48小時后愈合面積均大于未轉(zhuǎn)染EPCs(EPCs)和轉(zhuǎn)染了對照病毒Ad-GFP 的EPCs(Ad-GFP-EPCs),提示Ad-hTK1轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖活性和遷移能力(P0.05);(5)Ad-hTK1-EPCs細(xì)胞裂解液中NO含量高于EPCs和Ad-GFP-EPCs(P0.05);(6)Ad-hTK1-EPCs穩(wěn)定表達(dá)hTK1蛋白,eNOS蛋白表達(dá)水平高于EPCs和Ad-GFP-EPCs(P0.05)。2、動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)與NC組比較,模型組大鼠一般狀況較差,存活數(shù)減少,造模2周、4周的體重增加減少。其中2周時體重增加數(shù)值比較,MCT+PBS組、MCT+EPCs組和NC組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MCT+PBS組和MCT+Ad-hTK1-EPCs組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(2)四個動物組超聲心動圖參數(shù)比較,隨著時間延長,PAH模型組特別是MCT+PBS組、MCT+EPCs組的RVAWT、PAD/AOD、RVEDD/RVEDL測算值逐漸增大,PAAT、PAAT/PAET、TAPSE測算值逐漸減小。MCT+PBS組PAD/AOD、PAAT、PAAT/PAET、RVEDD/RVEDL的測算值與NC組、MCT+Ad-hTK1-EPCs組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);MCT+EPCs組的PAAT、PAAT/PAET測算值與NC組、MCT+Ad-hTK1-EPCs組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)四組動物實(shí)驗(yàn)前,造模2周、4周血清NO變化情況為MCT+Ad-hTK1-EPCs組血清NO含量持續(xù)增高,與其他3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);MCT+PBS組血清NO含量持續(xù)降低,2周時測值和其他3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),4周時與NC組、MCT+Ad-hTK1-EPCs組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);MCT+EPCs組血清NO含量2周時升高,高于NC組和MCT+PBS組,低于MCT+Ad-hTK1-EPCs組(P0.05),4周時降低,與NC組、MCT+Ad-hTK1-EPCs組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NC組血清NO含量4周時增高但低于MCT+Ad-hTK1-EPCs組(P0.05);(4)右室測壓顯示模型組PASP、PAMP和dp/dtmax、dp/dtmin升高,MCT+PBS 組的 PASP、PAMP 和 dp/dtmax、dp/dtmin 測值與 NC 組和MCT+Ad-hTK1-EPCs組測值間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MCT+EPCs組的PASP、dp/dtmax測值與NC組測值間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(5)模型組RVHI增大,肺小動脈WT%和WA%增大,MCT+PBS組改變明顯,與NC組、MCT+Ad-hTK1-EPCs組間差異有或近似有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P≈0.05);(6)四組動物肺組織蛋白表達(dá)情況顯示MCT+Ad-hTK1-EPCs組表達(dá)hTK1、eNOS蛋白;(7)Ad-GFP-EPCs的綠色熒光在大鼠心、肝、脾、肺、腎中都可見,心臟分布較少,并且主要分布在各器官的血管壁、血竇等部位。結(jié)論和意義:hTK1基因修飾EPCs增殖活性和遷移能力增強(qiáng),Ad-hTK1-EPCs穩(wěn)定表達(dá)hTK1、eNOS蛋白和釋放NO產(chǎn)物;靜脈移植Ad-hTK1-EPCs改善MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH血流動力學(xué)和病理改變,與預(yù)防性干預(yù)策略在PAH發(fā)生早期提高了血清NO含量可能有關(guān)。
【圖文】：

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文附圖表（Ａｔｔａｃｈｅｄ邋ｄｉａｇｒａｍｓ）逡逑－，「〕—邐ｍ邋ｉ邋Ｍ逡逑Ｍ邋『一＿逡逑圖１Ａ－Ｂ示分離出的股骨、脛骨，盡量將下肢骨剝離干凈并注意無菌操作是用大鼠骨髓源性單個核細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心后骨髓沖洗液的箭頭所示為第三層，單個核細(xì)胞層。逡逑

邐ｍ邋ｉ邋Ｍ逡逑Ｍ邋『一＿逡逑圖１Ａ－Ｂ示分離出的股骨、脛骨，盡量將下肢骨剝離干凈并注意無菌操作；圖１Ｃ逡逑是用大鼠骨髓源性單個核細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心后骨髓沖洗液的分層，紅逡逑箭頭所示為第三層，單個核細(xì)胞層。逡逑ａ邐ｂ邐ｃ逡逑ｄ邐ｅ邐ｆ逡逑９邐ｈ邐ｉ逡逑圖２示倒置顯微鏡明場４０ｘ邋（ａ／ｃ／ｅ／ｇ／ｈ），ｌＯＯｘ邋（ｂ／ｄ／ｆ／ｉ）原代細(xì)胞培養(yǎng)不同時間（ａ逡逑－ｂ，４天；ｃ－ｄ，邋７天；ｅ－ｆ，，邋１４－２１天）和傳代細(xì)胞（ｇ，ｈ，ｉ）所見細(xì)胞形態(tài)。原代逡逑細(xì)胞４天貼壁和開始生長；７天開始出現(xiàn)細(xì)胞集落；１４－２１天集落融合，可以傳代，逡逑細(xì)胞呈“鋪路石”樣；傳代細(xì)胞可見較小細(xì)胞集落，集落外細(xì)胞生長類似內(nèi)皮細(xì)胞，逡逑３５逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R544.1;R-332

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6 王

本文編號：2662247