【摘要】：孢子絲菌病是由雙相真菌孢子絲菌引起的一種常見皮膚疾病,目前在世界各地均有分布,在我國(guó)東北三省特別常見。病變通常局限于皮膚、皮下細(xì)胞組織和鄰近淋巴管。也可傳播到其他器官,罕見情況下,吸入分生孢子會(huì)導(dǎo)致人體系統(tǒng)性疾病,嚴(yán)重時(shí)甚至對(duì)人體生命構(gòu)成威脅。目前針對(duì)孢子絲菌病的研究主要集中在基因分型,流行病學(xué)和藥物敏感性等方面。該疾病臨床診斷主要依靠1,3-β-D-葡聚糖試驗(yàn)(G試驗(yàn))、半乳甘露聚糖(GM)試驗(yàn)、培養(yǎng)法以及病理組織染色等,其方法靈敏度和特異性較差,確診時(shí)間較長(zhǎng),急需一種簡(jiǎn)單快速,靈敏度高的血清診斷技術(shù)與相應(yīng)產(chǎn)品,以滿足臨床對(duì)該疾病的快速檢測(cè)需求。目前已報(bào)道的我國(guó)孢子絲菌病的常見致病菌株有申克氏孢子絲菌、巴西孢子絲菌、球形孢子絲菌三種,但我國(guó)尤其是東北三省其臨床主要致病菌株尚無(wú)法確定,針對(duì)致病菌的特異性檢測(cè)抗原也有待挖掘。因此,本研究主要目標(biāo)有三個(gè),其一為確定所獲得的臨床病人血清樣本中的主要致病菌類型及其抗原;其二,針對(duì)上述致病菌及抗原特點(diǎn),通過(guò)多種手段開發(fā)并制備可與孢子絲菌病患者血清中抗體結(jié)合的抗原,并用于孢子絲菌病快速檢測(cè)方法的構(gòu)建中。其三,為了有效預(yù)防控制此病的傳播,加速患者康復(fù)進(jìn)程,需要開發(fā)有效的殺菌系統(tǒng)對(duì)此菌有高效的殺滅作用。當(dāng)前致病菌抗原制備大多以原核表達(dá)為主,主要考慮到系統(tǒng)表達(dá)穩(wěn)定且易于大批量制備的特點(diǎn)。我們首先以世界范圍內(nèi)孢子絲菌病流行性最廣,研究最為深入的申克氏孢子絲菌為代表菌株,調(diào)取其特異性抗原gp70基因,同時(shí)構(gòu)建pET-28a(+)和pET-43.1兩種原核表達(dá)體系,分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21和Rosetta,并使用Bradford法測(cè)定表達(dá)蛋白濃度。結(jié)果顯示BL21菌株的蛋白表達(dá)量高于Rosetta。進(jìn)一步大量誘導(dǎo)表達(dá)gp70-His和gp70-TEV-NusA-His兩種蛋白,后者經(jīng)TEV酶切后分離效率較低。使用大量表達(dá)的gp70-His蛋白通過(guò)間接ELISA方法和Western Blotting檢測(cè)表達(dá)抗原的特異性,結(jié)果顯示原核表達(dá)的gp70抗原與病人血清樣本中抗體的結(jié)合缺乏特異性�？紤]到孢子絲菌為真核生物,原核系統(tǒng)表達(dá)可能因缺乏蛋白的空間折疊和糖基位點(diǎn)的修飾從而影響了正確抗原表位的形成,后續(xù)工作考慮使用具有蛋白翻譯后修飾功能的真核表達(dá)體系。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了 gp70-TEV-His-pPICZalphaB的重組質(zhì)粒,成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33,表達(dá)的糖蛋白抗原經(jīng)血清學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)仍然存在特異性及靈敏性不足的問(wèn)題,此結(jié)果側(cè)面反應(yīng)我國(guó)東北三省主要流行的孢子絲菌病并非由申克氏孢子絲菌所導(dǎo)致,且其抗原特性與申克氏菌不一致。為此,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,直接提取從臨床孢子絲菌病患者分離得到的孢子絲菌天然抗原,并對(duì)其進(jìn)行鑒定。由于酵母相孢子絲菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密,單一方法難以完成。最終采用物理方法結(jié)合酶解技術(shù),使嵌在細(xì)胞壁的糖蛋白得以釋放。通過(guò)蛋白提取物與孢子絲菌病患者血清抗體的結(jié)合,經(jīng)SDA-PAGE以及Western Blotting分析,我們發(fā)現(xiàn)該抗原大小為80KD。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)此蛋白三維結(jié)構(gòu)與gp70存在一定差異。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),80KD蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的球形孢子絲菌具有高度序列相似性。為了達(dá)到預(yù)防、控制病源傳播的目的,需要有效的殺菌系統(tǒng)對(duì)此菌進(jìn)行高效殺滅。傳統(tǒng)紫外燈含有大量汞,對(duì)環(huán)境的污染不可逆,我們通過(guò)電子激勵(lì)束研制無(wú)汞光源并用于物體表面殺菌。通過(guò)對(duì)已發(fā)表的殺菌文獻(xiàn)調(diào)研,開發(fā)的新型殺菌系統(tǒng)使用較低輻照劑量具有明顯的殺菌效果,此劑量低于Mohr,H.和Gravemann,U.使用300 mJ/cm~2(3.0×10~3 mW·s/cm~2)輻照計(jì)量殺滅血小板濃縮物中的10種菌,并且同時(shí)我們對(duì)殺菌機(jī)理做了進(jìn)一步研究。綜上所述,我國(guó)東北三省孢子絲菌病的主要致病菌類型為球形菌。通過(guò)物理方法結(jié)合酶解技術(shù)提取的臨床分離株80KD純化抗原與gp70蛋白比對(duì),三維結(jié)構(gòu)存在差異。該80KD蛋白對(duì)病人血清抗體顯示出高度親和力和良好的特異性,從而為下一步臨床孢子絲菌檢測(cè)試劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。除此之外我們還探究了深紫外對(duì)表面孢子絲菌的殺滅效果,為預(yù)防孢子絲菌病提供了可參考資料。
【圖文】：

ｏｔｔｉｎｇ邋檢測(cè)逡逑ｂａ－Ｆｉｅｒｒｏ文獻(xiàn)［１１３］。逡逑的構(gòu)建逡逑＋）邋－ｇｐ７０－Ｈｉｓ重組質(zhì)粒的構(gòu)建逡逑８ａ邋（＋）邋－ｇｐ７０－Ｈｉｓ連接產(chǎn)物，按照２３圖２．３所示。圖中泳道２顯示出６４００邋期條帶大小相符。對(duì)比未經(jīng)酶切的質(zhì)邋）和ｇｐ７０－Ｈｉｓ重組成功。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。使用菌落ＰＣＲ確重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)重組質(zhì)粒１邐２邋Ｍ逡逑

２．４＿１．２邋重組質(zhì)粒邋ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ邋的構(gòu)建逡逑取丨００叩口￡丁哪７０－１￡￥－燦５八－１＾連接產(chǎn)物，按照２．３．１．２所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)逡逑行重組質(zhì)粒的酶切，結(jié)果如圖２．４所示。圖中泳道２顯示出７９００邋ｂｐ與１２００邋ｂｐ逡逑兩條分子量不同的條帶，與預(yù)期條帶大小相符。對(duì)比未經(jīng)酶切的質(zhì)�，F(xiàn)實(shí)的單逡逑一條帶，初步說(shuō)明ｐＥＴ－４３．１和ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ重組成功。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，逡逑使用２．３．１中所述方法進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。使用菌落ＰＣＲ確認(rèn)陽(yáng)逡逑性克隆后（此部分?jǐn)?shù)據(jù)未展示），提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)重組質(zhì)�；蛐蝈义狭型耆_。逡逑ＪｊｍＵ｜５０００ｂｐ逡逑３１０００逡逑圖２．４邋ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證逡逑１：未經(jīng)酶切的ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ重組質(zhì)粒；２：經(jīng)ＢａｍＨＩ和Ｈｉｎｄｌｌｌ酶切后的逡逑ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ邋重組質(zhì)粒；３：核酸邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑２．４．２重組蛋白表達(dá)逡逑將已確定分別轉(zhuǎn)入邋ｐＥＴ２８ａ邋（＋）邋－ｇｐ７０－Ｈｉｓ，，邋ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ邋質(zhì)粒逡逑的陽(yáng)性菌株按照２．３．２．Ｉ方法進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。分別取未誘導(dǎo)菌體、誘導(dǎo)后逡逑上清、誘導(dǎo)后沉淀及破碎懸液，使用２３．２．４方法進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如２．５所逡逑示。通過(guò)圖中可在４３邋ＫＤ左右見到明顯誘導(dǎo)條帶，說(shuō)明蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。逡逑使用上述同樣方法進(jìn)行ｐＥＴ－ｇｐ７０－ＴＥＶ－ＮｕｓＡ－Ｈｉｓ質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如逡逑圖２．６所示。通過(guò)圖中可在９７邋ＫＤ左右見到明顯誘導(dǎo)條帶
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392

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6 郭亞南;O疵撾

本文編號(hào)：2662220