【摘要】：1研究背景與目的Wip1(Wild-type p53-induced phosphatase 1)屬于蛋白磷酸酶PP2C家族,通過去磷酸化p53和p38 MAPK等促進癌癥的發(fā)生發(fā)展,Wipl在乳腺癌和肺癌等許多腫瘤中都存在著高表達的現(xiàn)象。然而通過前期實驗和查閱文獻,課題組卻發(fā)現(xiàn)抑制Wipl后肝臟再生加快,已有研究證實Wipl基因敲除小鼠的肝臟再生速度明顯增快。如果存在針對Wipl靶點的促進肝再生的藥物,將會對活體肝移植和肝大部切除的患者提供很大的幫助。本研究通過2/3肝切除小鼠,研究Wipl磷酸酶抑制劑GSK2830371對小鼠肝臟再生以及再生中有氧糖酵解的影響;進一步研究GSK2830371對人正常肝細胞系L02的影響。2實驗方法2.1動物實驗選取40只7-8周體重為22.5-24 g的C57BL6/J雄性小鼠,隨機分為兩組,飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。將GSK2830371溶解于DMSO,實驗組腹腔注射lmg GSK2830371,對照組注射等體積的DMSO。無菌條件下將所有小鼠2/3肝切除,術(shù)后同樣方法隔天給藥一次。不同時間點處死各組小鼠3-4只,小心取出老鼠肝臟,肝臟/體重比和BrdU免疫組化檢測肝臟再生情況。2.2細胞實驗將L02肝細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中,細胞生長環(huán)境為37℃ 5%C02的濕潤培養(yǎng)箱。代謝實驗前12h,取細胞均勻種植在6、12或96孔板中,使用不含血清的DMEM饑餓處理。實驗時使用含GSK2830371的DMEM處理實驗組細胞,等體積的DMEM處理對照組細胞。2.3葡萄糖和乳酸含量測量于不同時間點收集上層培養(yǎng)基;低溫超聲法提取新鮮小鼠肝臟的組織勻漿。酶學(xué)比色法試劑盒檢測葡萄糖和乳酸的含量。2.4細胞內(nèi)ATP水平檢測于不同時間點收集細胞,提取細胞裂解液�；瘜W(xué)發(fā)光法檢測細胞中ATP的水平。2.5線粒體活性檢測根據(jù)CCK-8的原理,OD值表示整體的線粒體活性,用不同濃度的GSK2830371刺激L02細胞,CCK-8檢測細胞的線粒體活性。2.6流式細胞技術(shù)使用流式細胞技術(shù)PI染色檢測GSK2830371對L02細胞周期的影響。2.7關(guān)鍵酶活性的測量于不同時間點收集細胞,取新鮮小鼠肝臟組織,提取蛋白質(zhì),酶學(xué)比色法試劑盒檢測細胞和肝組織中糖酵解關(guān)鍵酶HK、PFK、PK和LDH的酶活性。2.8 QRT-RCR于不同時間點收集細胞,提取RNA,QRT-RCR檢測細胞中HIFlα、PDK1、GLUT1和MCT4的mRNA表達情況。2.9 Western blot于不同時間點收集細胞,提取兩組細胞蛋白質(zhì),western blot檢測糖酵解相關(guān)蛋白的表達情況。2.10免疫組化使用免疫組化BrdU染色法檢測兩組小鼠肝臟再生情況。3結(jié)果3.1小鼠肝部分切除后,GSK2830371能促進肝臟再生。小鼠肝部分切除后,經(jīng)GSK2830371治療小鼠的ILBW(Cindex of liver to body weight)比對照組小鼠的高。免疫組化也顯示,在GSK2830371治療小鼠的肝組織中,BrdU染色陽性的細胞數(shù)目比對照小鼠肝組織中的多。3.2小鼠肝部分切除后,GSK2830371能提高小鼠肝臟的有氧糖酵解水平。兩組小鼠的新鮮肝臟組織樣本檢測結(jié)果表明,GSK2830371治療組小鼠肝組織中的乳酸水平高于對照組。小鼠肝切除后36h和48h,GSK2830371治療組小鼠肝組織PFK、HK和LDH的酶活性也高于對照組小鼠,PK的酶活性沒有明顯差異。3.3 GSK2830371能提高L02肝細胞的有氧糖酵解水平并抑制細胞的線粒體有氧呼吸。經(jīng)GSK2830371刺激細胞的葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)量高于對照組,相應(yīng)的GLUT1和MCT4的mRNA表達量高于對照組。經(jīng)GSK2830371刺激的細胞的線粒體的活性明顯低于對照組,相應(yīng)的細胞內(nèi)ATP水平低于對照組。經(jīng)GSK2830371刺激細胞的糖酵解關(guān)鍵酶HK、PFK和LDH的酶活性均高于對照組。3.4 GSK2830371部分通過mTOR/HIFlα途徑提高L02肝細胞的有氧糖酵解水平。經(jīng)GSK2830371刺激細胞的mTOR蛋白表達量及其磷酸化水平明顯高于對照組。已有很多研究證明激活的mTOR可以通過HIFlα途徑提高糖酵解水平,進一步QRT-PCR證實了mTOR下游的HIFlα、PDK、GLUTl 和 MCT4的mRNA表達量均有不同程度的增加,HK2蛋白表達量也輕微增加。其中,PDK能磷酸化丙酮酸脫氫酶進而導(dǎo)致其活性的降低,GLUT1能促進細胞對葡萄糖的吸收,MCT4能促進細胞對乳酸的排泄。4結(jié)論Wipl磷酸酶抑制劑GSK2830371能夠促進肝臟的再生并能提高肝臟細胞有氧糖酵解的水平;GSK2830371部分通過mTOR/HIFlα途徑促進肝細胞有氧糖酵解的提升。
【圖文】：

圖２小鼠肝部分切除后，ＧＳＫ２８３０３７１對小鼠肝臟有氧糖酵解水平的影響。逡逑（Ａ）小鼠ＰＨ后，不同時間ＧＳＫ２８３０３７１治療組和對照組小鼠的肝臟中乳酸含逡逑量（每個時間點ｎ邋＝邋６－８）。結(jié)果表示為平均值土ＳＥＭ，邋＊Ｐ＜０．０５，Ｎ．Ｓ．無逡逑顯著差異。逡逑（Ｂ－Ｅ）小鼠ＰＨ后，不同時間ＧＳＫ２８３０３７１治療組和對照組小鼠的肝臟中ＨＫ、逡逑ＰＦＫ、ＰＫ和ＬＤＨ的活性（每個時間點ｎ邋＝邋６－８）。結(jié)果表示為平均值±ＳＥＭ，逡逑＊尸＜０．０５，Ｎ．Ｓ．無顯著差異。逡逑

圖３邐ＧＳＫ２８３０３７１對Ｌ０２肝細胞有氧糖酵解水平的影響。逡逑（Ａ－Ｃ）不同濃度的ＧＳＫ２８３０３７１刺激Ｌ０２肝細胞２４、４８和７２小時后的線粒體逡逑活性（每個時間點下每個濃度ｎ邋＝邋６）。結(jié)果表示為平均值±ＳＥＭ，＜０．０５，逡逑＊＊？邋＜０．０１，＊＊＊＊？邋＜０．００１，邋Ｎ．Ｓ．無顯著差異。逡逑（Ｄ）不同時間ＧＳＫ２８３０３７１刺激組和對照組Ｌ０２肝細胞的葡萄糖消耗量（每個逡逑時間點ｎ邋＝邋６，約１．８Ｍ０６個Ｌ０２細胞培養(yǎng)于１．５ｍＬＤＭＥＭ中）。結(jié)果表示逡逑為平均值士ＳＥＭ，邋＊Ｐ＜０．０５。逡逑（Ｅ）不同時間ＧＳＫ２８３０３７１刺激組和對照組Ｌ０２肝細胞的乳酸產(chǎn)量（每個時間逡逑點ｎ邋＝邋６，邋Ｌ０２細胞的數(shù)量約為０．２ｘ１０６，培養(yǎng)基的體積為ｌｍＬ）。結(jié)果表示逡逑為平均值土ＳＥＭ，＊Ｐ邋＜０．０５，林戶＜０．０１，Ｎ．Ｓ．無顯著差異。逡逑（Ｆ）不同時間ＧＳＫ２８３０３７１刺激組和對照組Ｌ０２肝細胞的線粒體活性（每個時逡逑間點ｎ邋＝邋６）。結(jié)果表示為平均值土ＳＥＭ，，邋＊尸＜０．０５，邋＊＊尸＜０．０１。逡逑（Ｇ）不同時間ＧＳＫ２８３０３７１刺激組和對照組Ｌ０２肝細胞的胞內(nèi)ＡＴＰ水平（每逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R333.4

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本文編號：2661864