【摘要】：目的:通過建立慢性酒精暴露的大鼠模型,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot),透射電鏡和IP-MS技術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段,觀察成癮與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)(海馬、內(nèi)側(cè)前額葉皮層和杏仁核)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá)情況以及這些腦區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)的改變,并通過尋找MMP-9相互作用蛋白,探討MMP-9在慢性酒精暴露過程中的作用及可能機(jī)制,為進(jìn)一步揭示酒精暴露導(dǎo)致的成癮記憶和行為提供新的理論依據(jù)。方法:將七周齡的雄性大鼠隨機(jī)分為以下三組:酒精組(EtOH)、麥芽糖組(Maltose)、自由飲食對(duì)照組(Chow)。對(duì)大鼠給予間斷性灌胃,連續(xù)灌胃兩天,戒斷兩天,依此類推,直至第28天。酒精組每天灌酒精(4 g/kg)、麥芽糖組每天灌同酒精組相等熱量的麥芽糖(7 g/kg)、自由飲食對(duì)照組每天自由飲水。然后在模型建立過程當(dāng)中的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第0、2、4、14、16、26、28天)取海馬、mPFC和杏仁核組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn):(1)血液酒精濃度和體重測(cè)定:在灌胃后30 min內(nèi)采用大鼠尾靜脈取血的方法取少量新鮮血液0.2 ml,隨后立即用頂空氣相色譜法測(cè)定血液中酒精濃度。(2)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定大鼠海馬、mPFC、杏仁核組織在CIE的不同階段MMP-9 mRNA的表達(dá)量。(3)用蛋白質(zhì)免疫印跡Western Blot的方法測(cè)定大鼠海馬、mPFC、杏仁核等組織在CIE的不同階段MMP-9蛋白的表達(dá)量。(4)利用透射電鏡觀察經(jīng)慢性間斷性酒精暴露后,海馬、mPFC、杏仁核突觸的界面結(jié)構(gòu)較對(duì)照組的改變情況。(5)用IP-MS/MS方法分析在CIE模型中海馬腦區(qū)與MMP-9相互作用的蛋白。結(jié)果:(1)建立慢性間斷性酒精暴露模型,對(duì)酒精組大鼠在連續(xù)灌胃兩天后、戒斷兩天后的同一時(shí)間點(diǎn)(每次灌酒精選取相同時(shí)間點(diǎn)),即在初始灌酒精第2天、第4天、第14天、第16天、第26天、第28天,進(jìn)行尾靜脈采血測(cè)定血酒精濃度(blood ethanol concentration,BEC)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,當(dāng)天灌酒精組血酒精濃度明顯升高(P0.01)。在整個(gè)模型建立期間,三組大鼠體重都逐漸增高,各組之間沒有顯著差異。表明模型建立成功。(2)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在海馬組織中,MMP-9的mRNA表達(dá)量從酒精急性暴露階段即Day 2開始增高(P0.01),在慢性酒精暴露早期即Day 14(P0.01),在慢性酒精暴露晚期即Day 26(P0.01),MMP-9的mRNA表達(dá)也呈升高狀態(tài)。同時(shí),在酒精戒斷階段即Day 4、Day 16、Day 28三個(gè)時(shí)間點(diǎn),MMP-9 mRNA的表達(dá)量同樣升高(P0.05)。在mPFC中,MMP-9 mRNA的表達(dá)量也出現(xiàn)類似的從Day 2開始持續(xù)到Day 28的升高的情況,在Day 2(P0.05)、Day 4(P0.05)、Day 14(P0.05)、Day 16(P0.05)、Day 26(P0.05)、Day 28(P0.05)。在杏仁核腦區(qū),MMP-9 mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組均無顯著差異。但是,在杏仁核中檢測(cè)到MMP-2的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組有升高。在麥芽糖組中,三個(gè)腦區(qū)的七個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)顯示,MMP-9 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異。(3)蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)的結(jié)果顯示,與Day 0相比,海馬組織中Total MMP-9及其活性形式Active MMP-9的蛋白表達(dá)量從急性戒斷期即Day 4開始明顯升高(P0.05),逐步上升并一直持續(xù)到Day 28(P0.01)。在mPFC中,與Day 0相比,Total MMP-9的蛋白表達(dá)從慢性暴露的早期(Day 14)開始明顯增高(P0.01)。在慢性戒斷的早期(Day 16)(P0.05),在慢性暴露的晚期(Day 26)(P0.01)和慢性戒斷的晚期(Day 28)(P0.01)均明顯升高。Active MMP-9的蛋白表達(dá)在慢性暴露的早期(Day 14)最早出現(xiàn)明顯升高(P0.05),而后在慢性暴露和戒斷的晚期明顯升高即Day 26(P0.05)、Day 28(P0.01)。(4)透射電鏡結(jié)果顯示,與對(duì)照組即Day 0相比,在CIE酒精暴露后期的海馬、mPFC、杏仁核這三個(gè)腦區(qū)均有突觸界面曲率增大,突觸后膜致密物厚度增加,突觸前后膜之間的間隙增大的現(xiàn)象。(5)通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀及質(zhì)譜分析方法篩選找到,在慢性酒精間斷性暴露期間與MMP-9發(fā)生相互作用的一些蛋白,包括Itgb1、Src、Eef1a、微管蛋白(Tubulin)、肌動(dòng)蛋白(Actin)和組蛋白H2B(Histone H2B)等。結(jié)論:(1)在大鼠海馬和mPFC組織中,慢性酒精間斷性暴露后MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯升高,而在杏仁核中MMP-9的表達(dá)量無顯著性差異。同時(shí),MMP-2的mRNA表達(dá)在杏仁核中有升高。(2)慢性酒精間斷性暴露導(dǎo)致大鼠海馬、mPFC、杏仁核等腦區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)突觸界面曲率增大、突觸后膜致密物厚度增加、突觸間隙增大。(3)我們找到一些在慢性酒精暴露過程中MMP-9的相互作用蛋白,為下一步的分子機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

用于后續(xù) Real time-PCR 和 Western blot實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)流程如下圖 1 所示：圖 1 實(shí)驗(yàn)流程圖1.3.2 血酒精濃度的測(cè)定用 10 %水合氯醛 350 mg/kg 腹腔注射麻醉，用干凈的刀片切割大鼠尾部約 3mm 處，，收集血液約 0.2 ml 后離心分離獲得血清，立即用頂空氣相色譜儀進(jìn)行血液酒精濃度的測(cè)定。1.3.3 熒光定量 PCR（1）取材 分離出大鼠海馬、前額葉皮層、杏仁核組織，放入無酶 EP 管后立即放入液氮速凍，然后存放到-80℃冰箱中備用。（2）總 RNA 提取 按照總 RNA 抽提純化試劑盒的說明來提取各組不同腦區(qū)

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié) 果2.1 慢性間斷性酒精暴露模型（CIE）的建立在慢性酒精暴露期間，酒精組大鼠在灌胃后半小時(shí)內(nèi)測(cè)得的血酒精濃度和對(duì)照組大鼠的血酒精濃度見圖 1-1a，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠灌酒精后平均血酒精濃度為 80mg/dl，而對(duì)照組檢測(cè)不到酒精，提示模型建立成功。圖 1-1b 記錄了在造模期間各組大鼠體重的變化情況，三組相比較無顯著差異。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R-332;R749.6

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本文編號(hào)：2661078