【摘要】：目的 構(gòu)建百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase toxin,CyaA/ACT)及其結(jié)構(gòu)域RTX(repeat-in-toxin,RTX)的表達(dá)質(zhì)粒,獲得純度較高的CyaA和RTX蛋白。利用小鼠百日咳氣霧感染模型來(lái)評(píng)估腺苷酸環(huán)化酶類(lèi)毒素抗原RTX和新型佐劑單磷酸脂質(zhì)A(monophosphoryl lipid A,MPLA)在無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗中(acellular pertussis vaccine,aP)中的免疫保護(hù)效果,從而更好地理解在小鼠感染模型中繼續(xù)改善aP的方法。方法 本研究的第一部分從百日咳CS株基因組中以PCR方法獲取了 CyaA、CyaA 的修飾基因—賴(lài)氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶(cyclolysin activating lysine acyltransferase,CyaC)和CyaA中的結(jié)構(gòu)域RTX基因(CyaA的類(lèi)毒素形式)并分別克隆到pET-Duet-1 和 pET-28a 表達(dá)載體上,構(gòu)建 pET-Duet-l-CyaC-CyaA 和 pET-28a-RTX兩個(gè)表達(dá)載體,并在BL21中進(jìn)行表達(dá)。在8M尿素中,應(yīng)用陰離子交換層析方法純化CyaA蛋白,利用鎳離子層析技術(shù)純化RTX蛋白,并由測(cè)序與Western blot的方法分別驗(yàn)證所表達(dá)目的蛋白的正確性。研究的第二部分在aP的基礎(chǔ)上配制了 aP+RTX、aP+MPLA、aP+RTX+MPLA以及aP+CyaA試驗(yàn)疫苗,并利用wP和生理鹽水為對(duì)照組以人用劑量(Human Dose,HD)的1/40進(jìn)行兩針的免疫接種程序(0和3周),經(jīng)腹腔免疫途徑免疫Balb/c小鼠。檢測(cè)小鼠免疫前與每次免疫后的抗體水平。在免疫完成后的一周采用氣霧攻擊的方式感染小鼠。在感染后的特定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組外周血白細(xì)胞水平、肺部、支氣管、肝臟和脾臟百日咳桿菌克隆數(shù)、外周血清和肺組織中的細(xì)胞因子水平以及脾臟T細(xì)胞分型。結(jié)果 第一部分中成功構(gòu)建了 pET-Duet-CyaC-CyaA和pET-28a-RTX兩個(gè)表達(dá)載體,并且在BL21中分別以包涵體與分泌的形式成功表達(dá)。在8M尿素中,應(yīng)用陰離子交換層析方法獲得了 CyaA蛋白;利用鎳離子層析技術(shù)獲得了 RTX蛋白,并通過(guò)測(cè)序和Western blot分別驗(yàn)證了所表達(dá)蛋白的正確性。第二部分中,除對(duì)照組和wP組,各無(wú)細(xì)胞疫苗組免疫完成后均誘導(dǎo)了較高的PT、FHA和PRN抗體水平;而無(wú)論是添加的CyaA還是RTX的疫苗組,都誘導(dǎo)了一定程度上的針對(duì)CyaA的抗體水平。另外MPLA和CyaA都具有一定的佐劑效應(yīng),而RTX并未發(fā)現(xiàn)有此效果。對(duì)照組在感染后的第6天白細(xì)胞水平開(kāi)始升高,并在第14天達(dá)到高峰,而wP組在第10天白細(xì)胞有所升高,第14天便迅速恢復(fù)至正常值,而各無(wú)細(xì)胞疫苗組在感染后的第14天白細(xì)胞均有輕微的升高,第21天便恢復(fù)至正常水平。對(duì)照組肺部和支氣管肺部菌落數(shù)在感染后的第2天均有明顯升高,在第14天達(dá)到高峰;而各疫苗組也均有一定量的細(xì)菌定植,此外,各組支氣管的定植數(shù)低于肺部,且氣管的清除速度也明顯快于肺部清除。細(xì)胞因子和T細(xì)胞分型分析結(jié)果表明,自然感染引起較高的Th1和Th17型細(xì)胞免疫,wP組與添加MPLA組也引起較高的Th1反應(yīng),而添加的CyaA組可明顯提高Th17反應(yīng),而添加RTX組在使用的劑量免疫下反而降低了 Th17反應(yīng)。結(jié)論RTX同CyaA一樣可誘導(dǎo)產(chǎn)生識(shí)別CyaA的抗體,但不具有佐劑效應(yīng),且誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)與CyaA也不盡相同,CyaA的加入顯著提高了Th17反應(yīng),而RTX的加入反而降低了 Th17反應(yīng);另外,CyaA的加入對(duì)小鼠呼吸道組織百日咳桿菌的清除率有明顯的提高,而RTX的單獨(dú)加入對(duì)組織中細(xì)菌的清除率沒(méi)有明顯改善。MPLA的單獨(dú)加入有極大的佐劑效應(yīng),而且有助于促進(jìn)Th1的反應(yīng),但對(duì)組織中細(xì)菌的清除率沒(méi)有明顯改善。RTX與MPLA共同使用也有極大的佐劑效應(yīng),且有助于提高肺組織局部的Th1細(xì)胞反應(yīng),此外,對(duì)小鼠氣管組織的百日咳清除有一定程度上的改善。
【圖文】：

未顯著改變這一發(fā)病率［７］。即使在疫苗覆蓋率超過(guò)９０％以上的國(guó)家，感染率能達(dá)逡逑到每年ＭＰ，８，＇基于國(guó)家百日咳監(jiān)查系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，美國(guó)、歐洲以及中國(guó)的百逡逑日咳發(fā)病率都呈現(xiàn)出相同的發(fā)病率增加趨勢(shì)（圖１）。全球百日咳發(fā)病率的增加逡逑可能反映了檢測(cè)方法學(xué)靈敏度的提高、疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)力和保護(hù)時(shí)間的有限以及逡逑病原體的適應(yīng)／進(jìn)化［１（），ｕ，１２，１３］。其中一個(gè)很重要的因素可能是目前使用的ａＰ無(wú)法逡逑在基礎(chǔ)免疫后誘導(dǎo)強(qiáng)效的細(xì)胞免疫，而強(qiáng)效的細(xì)胞免疫是疫苗介導(dǎo)長(zhǎng)期保護(hù)的必逡逑要條件［１４］。逡逑■■邋ｕＱ逡逑ＥＷＩｉＢｔｌｉＭＩＨｌＢ逡逑９逡逑

ＣｙａＡ是重復(fù)子毒素家族（ｒｅｐｅａｔｓ邋ｉｎ邋ｔｏｘｉｎ邋ｆａｍｉｌｙ）的成員之一，，含有１７０６逡逑個(gè)氨基酸殘基，由Ｎ－末端腺苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域（ａｄｅｎｙｌａｔｅ邋ｃｙｃｌａｓｅ邋ｄｏｍａｉｎ，逡逑ＡＣＤ）和Ｃ－末端溶血素結(jié)構(gòu)域（ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ，邋Ｈｌｙ）兩個(gè)功能不同的組成（圖２）逡逑［６１］。ＣｙａＡ－ＡＣＤ具有依賴(lài)鈣調(diào)蛋白（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，邋ＣａＭ）激活的ＡＴＰ環(huán)化酶活性，逡逑ＣｙａＡ－Ｈｌｙ具有溶血活性，這兩種活性都可以獨(dú)立發(fā)揮作用，即腺苷酸環(huán)化酶和逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2651066