【摘要】：目的 構(gòu)建百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase toxin,CyaA/ACT)及其結(jié)構(gòu)域RTX(repeat-in-toxin,RTX)的表達質(zhì)粒,獲得純度較高的CyaA和RTX蛋白。利用小鼠百日咳氣霧感染模型來評估腺苷酸環(huán)化酶類毒素抗原RTX和新型佐劑單磷酸脂質(zhì)A(monophosphoryl lipid A,MPLA)在無細胞百日咳疫苗中(acellular pertussis vaccine,aP)中的免疫保護效果,從而更好地理解在小鼠感染模型中繼續(xù)改善aP的方法。方法 本研究的第一部分從百日咳CS株基因組中以PCR方法獲取了 CyaA、CyaA 的修飾基因—賴氨酸�；D(zhuǎn)移酶(cyclolysin activating lysine acyltransferase,CyaC)和CyaA中的結(jié)構(gòu)域RTX基因(CyaA的類毒素形式)并分別克隆到pET-Duet-1 和 pET-28a 表達載體上,構(gòu)建 pET-Duet-l-CyaC-CyaA 和 pET-28a-RTX兩個表達載體,并在BL21中進行表達。在8M尿素中,應用陰離子交換層析方法純化CyaA蛋白,利用鎳離子層析技術(shù)純化RTX蛋白,并由測序與Western blot的方法分別驗證所表達目的蛋白的正確性。研究的第二部分在aP的基礎上配制了 aP+RTX、aP+MPLA、aP+RTX+MPLA以及aP+CyaA試驗疫苗,并利用wP和生理鹽水為對照組以人用劑量(Human Dose,HD)的1/40進行兩針的免疫接種程序(0和3周),經(jīng)腹腔免疫途徑免疫Balb/c小鼠。檢測小鼠免疫前與每次免疫后的抗體水平。在免疫完成后的一周采用氣霧攻擊的方式感染小鼠。在感染后的特定時間點檢測各組外周血白細胞水平、肺部、支氣管、肝臟和脾臟百日咳桿菌克隆數(shù)、外周血清和肺組織中的細胞因子水平以及脾臟T細胞分型。結(jié)果 第一部分中成功構(gòu)建了 pET-Duet-CyaC-CyaA和pET-28a-RTX兩個表達載體,并且在BL21中分別以包涵體與分泌的形式成功表達。在8M尿素中,應用陰離子交換層析方法獲得了 CyaA蛋白;利用鎳離子層析技術(shù)獲得了 RTX蛋白,并通過測序和Western blot分別驗證了所表達蛋白的正確性。第二部分中,除對照組和wP組,各無細胞疫苗組免疫完成后均誘導了較高的PT、FHA和PRN抗體水平;而無論是添加的CyaA還是RTX的疫苗組,都誘導了一定程度上的針對CyaA的抗體水平。另外MPLA和CyaA都具有一定的佐劑效應,而RTX并未發(fā)現(xiàn)有此效果。對照組在感染后的第6天白細胞水平開始升高,并在第14天達到高峰,而wP組在第10天白細胞有所升高,第14天便迅速恢復至正常值,而各無細胞疫苗組在感染后的第14天白細胞均有輕微的升高,第21天便恢復至正常水平。對照組肺部和支氣管肺部菌落數(shù)在感染后的第2天均有明顯升高,在第14天達到高峰;而各疫苗組也均有一定量的細菌定植,此外,各組支氣管的定植數(shù)低于肺部,且氣管的清除速度也明顯快于肺部清除。細胞因子和T細胞分型分析結(jié)果表明,自然感染引起較高的Th1和Th17型細胞免疫,wP組與添加MPLA組也引起較高的Th1反應,而添加的CyaA組可明顯提高Th17反應,而添加RTX組在使用的劑量免疫下反而降低了 Th17反應。結(jié)論RTX同CyaA一樣可誘導產(chǎn)生識別CyaA的抗體,但不具有佐劑效應,且誘導的細胞免疫反應與CyaA也不盡相同,CyaA的加入顯著提高了Th17反應,而RTX的加入反而降低了 Th17反應;另外,CyaA的加入對小鼠呼吸道組織百日咳桿菌的清除率有明顯的提高,而RTX的單獨加入對組織中細菌的清除率沒有明顯改善。MPLA的單獨加入有極大的佐劑效應,而且有助于促進Th1的反應,但對組織中細菌的清除率沒有明顯改善。RTX與MPLA共同使用也有極大的佐劑效應,且有助于提高肺組織局部的Th1細胞反應,此外,對小鼠氣管組織的百日咳清除有一定程度上的改善。
【圖文】：

未顯著改變這一發(fā)病率［７］。即使在疫苗覆蓋率超過９０％以上的國家，感染率能達逡逑到每年ＭＰ，８，＇基于國家百日咳監(jiān)查系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，美國、歐洲以及中國的百逡逑日咳發(fā)病率都呈現(xiàn)出相同的發(fā)病率增加趨勢（圖１）。全球百日咳發(fā)病率的增加逡逑可能反映了檢測方法學靈敏度的提高、疫苗誘導的保護力和保護時間的有限以及逡逑病原體的適應／進化［１（），ｕ，１２，１３］。其中一個很重要的因素可能是目前使用的ａＰ無法逡逑在基礎免疫后誘導強效的細胞免疫，而強效的細胞免疫是疫苗介導長期保護的必逡逑要條件［１４］。逡逑■■邋ｕＱ逡逑ＥＷＩｉＢｔｌｉＭＩＨｌＢ逡逑９逡逑

ＣｙａＡ是重復子毒素家族（ｒｅｐｅａｔｓ邋ｉｎ邋ｔｏｘｉｎ邋ｆａｍｉｌｙ）的成員之一，，含有１７０６逡逑個氨基酸殘基，由Ｎ－末端腺苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域（ａｄｅｎｙｌａｔｅ邋ｃｙｃｌａｓｅ邋ｄｏｍａｉｎ，逡逑ＡＣＤ）和Ｃ－末端溶血素結(jié)構(gòu)域（ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ，邋Ｈｌｙ）兩個功能不同的組成（圖２）逡逑［６１］。ＣｙａＡ－ＡＣＤ具有依賴鈣調(diào)蛋白（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，邋ＣａＭ）激活的ＡＴＰ環(huán)化酶活性，逡逑ＣｙａＡ－Ｈｌｙ具有溶血活性，這兩種活性都可以獨立發(fā)揮作用，即腺苷酸環(huán)化酶和逡逑１３逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳洪希;肌醇六磷酸脂在低溫磷化中的應用[J];電鍍與精飾;2000年06期

2 陳彥澤,喻建良,丁信偉;肌醇六磷酸脂在熱管表面處理中的應用研究[J];化學工業(yè)與工程技術(shù);2003年06期

3 ;L—抗壞血酸—2—三聚磷酸脂(ASTP)[J];企業(yè)技術(shù)開發(fā);1995年04期

4 袁方;曾耀天;;磷酸脂淀粉在紡織上的應用[J];棉紡織技術(shù);1984年07期

5 張玉蘭;;克林霉素磷酸脂致小兒過敏性休克1例[J];中國臨床新醫(yī)學;2010年12期

6 陳建華,廖力微,肖誼;靜滴克林霉素磷酸脂致過敏性休克1例[J];云南醫(yī)藥;2000年06期

7 王身立;磷酸脂酰肌醇與陰陽學說[J];自然雜志;1990年10期

8 廖祥儒,蘆春斌,杜建芳,周艷芬,王建平;PEG和鎳處理對水稻細胞磷酸脂酶活性及再生的影響[J];西北植物學報;2001年04期

9 黃嵐,陳松華,戴慧敏,劉偉,葛錫銳;磷酸脂配體體外激活人外周血γδT細胞的研究[J];上海免疫學雜志;2000年01期

10 謝學義;因食用三鄰甲苯磷酸脂污染的面粉引起周圍神經(jīng)病暴發(fā)[J];西安醫(yī)科大學學報(中文版);1996年01期

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 撰文 董小軍邋厲國智;注射不久病人死亡,誰是誰非引發(fā)爭議[N];寧波日報;2007年

2 列歡;Nexia收到美國394萬加元訂單開發(fā)Protexia[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

3 吳祥;功能奇特的布[N];中國紡織報;2002年

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 江文文;腺苷酸環(huán)化酶類毒素抗原RTX和單磷酸脂質(zhì)A（MPLA）佐劑在無細胞百日咳疫苗中的免疫保護效果評價[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2019年

本文編號：2651066