【摘要】：寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)屬黃病毒科,黃病毒屬,是單股正鏈,具有包膜的RNA病毒,可通過(guò)蚊蟲(chóng)進(jìn)行傳播的蟲(chóng)媒病毒。最早在1947年于烏干達(dá)的寨卡森林中的獼猴體內(nèi)分離出來(lái),因而得名。該病毒活動(dòng)一直比較隱匿,自2015年初,巴西第一例ZIKV感染報(bào)道以來(lái),寨卡疫情于中南美洲快速擴(kuò)散,穿越太平洋,到達(dá)大約60個(gè)國(guó)家。嚴(yán)重的ZIKV感染可導(dǎo)致神經(jīng)方面疾病,如新生兒的小頭癥和成人的格林-巴利綜合征,引起大家廣泛的關(guān)注。然而,目前還沒(méi)有針對(duì)寨卡熱有效的疫苗或特異性的藥物。ZIKV生命周期由多個(gè)步驟組成,包括吸附,穿入,脫殼,生物合成,組裝與釋放等都需要與宿主因子相互作用。病毒感染相關(guān)宿主因子和病毒-宿主相互作用關(guān)系,為病毒生存策略奠定了基礎(chǔ),進(jìn)而為識(shí)別有效的宿主靶標(biāo)和抗病毒藥物研究提供有力工具。盡管目前有一些關(guān)于ZIKV和宿主細(xì)胞及信號(hào)通路的研究,但無(wú)法系統(tǒng)地識(shí)別ZIKV的宿主調(diào)節(jié)因子,阻礙了抗病毒藥物的發(fā)展和對(duì)病毒致病性的理解。鑒定調(diào)節(jié)ZIKV感染的宿主候選因子的快速方法是使用生物活性化合物庫(kù)進(jìn)行系統(tǒng)篩選。在本研究中,我們用2659個(gè)具有明確靶點(diǎn)的生物活性小分子化合物庫(kù),使用人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SNB-19作為體外感染模型,應(yīng)用高通量和基于熒光成像焦點(diǎn)的技術(shù)來(lái)識(shí)別調(diào)節(jié)ZIKV感染的宿主因子。5μM化合物庫(kù)篩選的結(jié)果顯示了一百多種小分子,明顯抑制或增強(qiáng)了 SNB-19細(xì)胞中的ZIKV感染。根據(jù)這些不同作用效果化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白,我們構(gòu)建了 ZIKV感染相關(guān)宿主調(diào)控因子的相互作用網(wǎng)絡(luò)。基于此蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò),我們后續(xù)開(kāi)展了病毒感染關(guān)鍵宿主因子的功能性研究。在高通量篩選中,一種MAP3K混合譜系酶3(Mixed Lineage Kinase 3,MLK3)抑制劑URMC-099顯著增強(qiáng)了 SNB-19細(xì)胞和新生小鼠大腦中的ZIKV的感染。MLK3屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,MLK3能磷酸化并活化絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAP2Ks),導(dǎo)致 c-Jun 氨基末端激酶(JUNN-Terminal Kinase,JNK),P38蛋白(p38MAPK,P38),細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK(MAPKs)介導(dǎo)的信號(hào)通路活化,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期進(jìn)展等過(guò)程。有關(guān)MLK3參與病毒的生命周期的相關(guān)報(bào)道較少。MLK3可以被腸道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)誘導(dǎo)激活。MLK3缺陷可導(dǎo)致流感病毒在肺部的清除延遲。然而,在ZIKV的感染中,MLK3的作用仍然是未知的。通過(guò)基因沉默和過(guò)表達(dá),我們進(jìn)一步證實(shí)MLK3是一種抑制ZIKV的宿主限制因子。從機(jī)制上來(lái)講,MLK3通過(guò)誘導(dǎo)部分炎癥細(xì)胞因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)負(fù)性調(diào)節(jié)ZIKV的復(fù)制,但不調(diào)節(jié)宿主抗病毒干擾素信號(hào)通路。而且,ZIKV能夠激活細(xì)胞和新生小鼠腦中的MLK3/MKK7/JNK通路。本項(xiàng)研究揭示了 MLK3獨(dú)特的抗病毒機(jī)制,并提示MLK3/MKK7/JNK信號(hào)通路的蛋白激動(dòng)劑在重新用作治療ZIKV時(shí)可能具有臨床效用。綜上所述,我們通過(guò)基于有明確靶點(diǎn)的生物活性庫(kù)的功能獲得高通量篩選技術(shù),系統(tǒng)認(rèn)識(shí)ZIKV感染相關(guān)宿主因子,構(gòu)建病毒相關(guān)宿主因子相互作用網(wǎng)絡(luò),為闡明ZIKV感染的調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ),并為發(fā)現(xiàn)ZIKV感染相關(guān)的生物標(biāo)志物和新的抗病毒靶點(diǎn)提供研究方向。本研究報(bào)導(dǎo)了 MLK3對(duì)ZIKV的負(fù)性調(diào)控作用,揭示了 MLK3調(diào)控的機(jī)制;MLK3及MLK3/MKK7/JNK信號(hào)通路參與部分炎癥因子(IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1)和病毒的相互作用及潛在的應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖１．混合譜系激酶（ＭＬＫ）家族的示意圖［７（）］逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ．邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍｉｘｅｄ邋ｌｉｎｅａｇｅ邋ｋｉｎａｓｅ邋（ＭＬＫ）邋ｆａｍｉｌｙ逡逑

圖２．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２．邋Ｐａｔｔｅｒｎ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａｎｉｍａｌ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑系逡逑的ｐｃＤＮＡ３．１－Ｃ－Ｍｙｃ－ＭＬＫ３質(zhì)粒用做慢病毒載體質(zhì)粒ｐ載體。逡逑一天將２９３Ｔ細(xì)胞傳代接至６孔板，第二天生長(zhǎng)密度約為天，轉(zhuǎn)染前，將２９３Ｔ細(xì)胞培養(yǎng)液換成新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)Ｋ３、２．５ｐｇＧａｇ／ｐｏｌ、０＿５ｐｇＶＳＶ－Ｇ邋加入邋１００（ｉＬＯｐｔｉ－ＭＥ／１＾）加入１００４（＾丨－＾＾＾１中，混勻＝將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試放在室溫靜置２０ｍｉｎ，，然后加入到細(xì)胞中６ｈ。換新鮮培胞培養(yǎng)上清，分裝，＿８０°Ｃ保存。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2649187