【摘要】：研究目的:通過對(duì)我國云南省部分地區(qū)蚊宏病毒組學(xué)及新分離乙型腦炎病毒特性進(jìn)行研究,分析云南省潛在的病毒種類及分布,以及新分離乙型腦炎病毒的變異及流行病學(xué),為今后該地區(qū)病毒病的防控及向其他地區(qū)傳播控制提供參考。材料與方法:(1)宏基因組學(xué):蚊樣品現(xiàn)場(chǎng)采集;實(shí)驗(yàn)室鑒定蚊種類并分組;蚊樣品研磨;研磨液上清過濾除菌;核酸酶降解宿主核酸;提取蚊樣品RNA獲得宏病毒組核酸;宏病毒組核酸反轉(zhuǎn)錄及SISPA擴(kuò)增合成sscDNA宏病毒組核酸序列;采用Klenow片段合成dscDNA宏病毒組核酸序列;Exon I及SAP去除寡聚核苷酸引物及游離核苷酸;dscDNA宏病毒組核酸序列SISPA擴(kuò)增;dscDNA宏病毒組核酸序列純化除去寡核苷酸;瓊脂糖凝膠電泳鑒定SISPA擴(kuò)增產(chǎn)物長度范圍;NanoDrop檢測(cè)dscDNA宏病毒組核酸序列純化產(chǎn)物濃度;第二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)宏病毒組核酸序列;注釋宏病毒組序列信息;特定病毒PCR/RT-PCR檢測(cè);擴(kuò)增序列Neighbor-joining進(jìn)化分析。(2)病毒特性研究:蚊樣品現(xiàn)場(chǎng)采集;實(shí)驗(yàn)室鑒定蚊種類并分組;蚊樣品研磨;Nested-PCR鑒定病毒種類;;特定病毒蚊樣品研磨液上清過濾除菌;無菌上清液接種BHK-21細(xì)胞傳代培養(yǎng);CPE,Nested-PCR,IFA,負(fù)染電鏡鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物特定病毒增殖;Neighbor-joining分析新分離乙型腦炎病毒變異及流行病學(xué)分析。結(jié)果:Illumina測(cè)序揭示了我國云南地區(qū)蚊病毒組成;通過基因注釋,超過50個(gè)病毒科被發(fā)現(xiàn)存在于云南蚊中,包括圓環(huán)病毒科、細(xì)環(huán)病毒科、細(xì)小病毒科和黃病毒科等多種病毒科;通過Illumina測(cè)序共獲得22,964,305個(gè)序列讀長,其平均長度為186個(gè)核苷酸,共獲得序列重疊群為10,538,636個(gè),重疊率占91.78%;分析Illumina測(cè)序結(jié)果并統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),三個(gè)樣品病毒序列所占比例分別為3.84%、17.84%、0.17%;根據(jù)病毒宿主對(duì)病毒序列進(jìn)行分類并統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),脊椎動(dòng)物病毒占87.4%,植物病毒占5.4%,真菌病毒占1%,昆蟲病毒和噬菌體分別占0.8%和0.6%;在此背景上,經(jīng)BLAST比對(duì)搜索及巢式PCR方法鑒定出三段DENV病毒序列、兩段ZIKV病毒序列及一段JEV病毒序列,DENV病毒序列分別為:一個(gè)1231個(gè)核苷酸長度的片段(DENV-China/YN2016-1)、一個(gè)491個(gè)核苷酸長度的片段(DENV-China/YN2016-2),以及一個(gè)939個(gè)核苷酸長度的片段(DENV-China/YN2016-3),其分別編碼部分非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A到NS5、部分囊膜蛋白E以及部分非結(jié)構(gòu)蛋白NS5;系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示DENV-China/YN2016-2屬于基因IV型DENV病毒;ZIKV病毒序列分別為:一個(gè)694個(gè)核苷酸長度的片段(ZIKV-China/YN2016-1)和一個(gè)470個(gè)核苷酸長度的片段(ZIKV-China/YN2016-2),其均編碼部分非結(jié)構(gòu)蛋白NS3;系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示ZIKV-China/YN2016-1屬于亞洲型ZIKV病毒;核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)DENV-China/YN2016-2與1991年DENV泰國分離株親緣關(guān)系最近,其同源性為95.3%,ZIKV-China/YN2016-1與2004年ZIKV泰國分離株親緣關(guān)系最近,其同源性為97.1%;通過IFA和負(fù)染電鏡實(shí)驗(yàn)對(duì)JEV病毒分離株JEV-China/YN2016-1進(jìn)行了鑒定;經(jīng)測(cè)定JEV-China/YN2016-1病毒滴度為6.30×105 TCID50/0.1mL,經(jīng)乳鼠接種,其半數(shù)致死量為3.16×103LD50/0.03mL;病理切片觀察發(fā)現(xiàn),乳鼠接種JEV-China/YN2016-1后,腦部出現(xiàn)了一系列病理變化,如液化性壞死、神經(jīng)性壞死、環(huán)狀出血、單核細(xì)胞增生以及膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)增生。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示JEV-China/YN2016-1屬于基因Ⅰ型JEV病毒;核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)JEV-China/YN2016-1與2009年JEV老撾分離株親緣關(guān)系最近,其同源性為98.8%;氨基酸變異分析發(fā)現(xiàn)在E蛋白340位纈氨酸或絲氨酸替換為丙氨酸。結(jié)論:(1)Illumina測(cè)序揭示了我國云南地區(qū)蚊含有豐富的病毒種類;(2)基因IV型DENV病毒和基因Ⅰ型JEV病毒依然在云南地區(qū)流行,ZIKV病毒已經(jīng)在該地區(qū)出現(xiàn)傳播痕跡;(3)JEV病毒在云南地區(qū)的分離及變異,預(yù)示其可能形成新的流行態(tài)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373.31

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本文編號(hào)：2645192