【摘要】：細胞治療作為一種新型的治療手段,目前已應用于多種疾病,全球范圍已有十余種干細胞產(chǎn)品上市,應用前景廣闊。骨質(zhì)疏松是最常見的一種骨疾病,其發(fā)生是由于破骨細胞的活性遠遠高于成骨細胞活性而導致的骨吸收與骨生成不匹配,最終導致骨量減少。目前治療的主要策略是抑制破骨細胞的過度激活從而減少骨量持續(xù)減少。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牙髓來源間充質(zhì)干細胞具有非常強的成骨能力。HGF是一種具有促進細胞存活、組織再生,抑制并改善慢性炎癥和纖維化,促進成骨細胞增殖,參與骨重塑的多功能細胞因子。因此,本實驗在此基礎上,對牙髓間充質(zhì)干細胞進行肝細胞生長因子(HGF)基因修飾,評價其對骨質(zhì)疏松的治療作用,并揭示其治療機制。首先,我們建立了牙髓間充質(zhì)干細胞(DPSCs)獲取、培養(yǎng)、鑒定、儲存等一系列的標準化操作規(guī)程,為DPSCs作為一種可靠的細胞治療產(chǎn)品提供了保障。同時我們比較了骨髓、臍帶、脂肪和牙髓這四種來源間充質(zhì)干細胞的成骨能力。利用實時熒光定量PCR的方法,從mRNA水平,觀察到成骨相關基因alp、runx2和oc在骨髓和牙髓來源的間充質(zhì)干細胞中高表達。我們擴增并純化了攜帶HGF的重組復制缺陷型腺病毒(Ad-HGF),用其感染DPSCs(DPSCs-HGF),在不影響DPSCs生物學特性的條件下,使DPSCs能夠分泌大量的HGF蛋白。通過熒光定量PCR和Western Blot的方法,驗證了經(jīng)過HGF基因修飾的DPSCs,其ALP、RUNX2和OC等成骨相關基因在mRNA和蛋白水平表達都顯著增加。為了觀察細胞給予小鼠后在小鼠體內(nèi)的分布規(guī)律,我們構(gòu)建了表達熒光素酶的重組腺病毒(Ad-Luc)。用Ad-Luc感染DPSCs(DPSCs-Luc),通過尾靜脈注射的方法將細胞移植到小鼠體內(nèi),運用小動物活體成像系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)其早期分布在肺臟,后期逐漸轉(zhuǎn)移到肝臟,并在肝臟持續(xù)存在超過一個月。整個觀察期未明顯觀察到細胞歸巢至骨量缺失處。在觀察終點,我們處死小鼠,將各器官取出,分別用小動物活體成像系統(tǒng)檢測,進一步證實細胞主要分布于肝臟,且仍未觀察到股骨內(nèi)有細胞分布。另外,我們還比較了細胞移植時機對于細胞在小鼠體內(nèi)分布的影響。我們選取的細胞移植時間分別是建立小鼠骨質(zhì)疏松模型后一天和一個月,經(jīng)尾靜脈注射DPSCs-Luc。通過比較兩組間熒光強度的強弱來間接比較不同時機進行DPSCs干預,細胞在小鼠體內(nèi)存活量的差別。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與造模后一個月給予細胞組相比,在造模后一天給予細胞治療,其在小鼠體內(nèi)熒光表達強度更強。上述結(jié)果提示,為獲得更佳的治療效果,應在造模后早期使用細胞治療。考慮到人來源的DPSCs在小鼠肝臟的長期存活可能影響其肝功能,我們還檢測了小鼠血清中的AST和ALT的表達水平,發(fā)現(xiàn)人源DPSCs-Null和DPSCs-HGF在小鼠肝臟存活6周并未影響小鼠的肝功能。其次,我們利用雙側(cè)卵巢切除的方法,建立了小鼠骨質(zhì)疏松模型。在C57BL/6小鼠卵巢切除一個月后,利用高分辨CT(μCT)評價小鼠股骨遠端骨小梁(松質(zhì)骨)的骨量情況,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過雙側(cè)卵巢切除術后,小鼠骨小梁的骨量顯著降低,而股骨的硬質(zhì)骨骨量變化不明顯,因此本實驗采用小鼠股骨的骨小梁骨量作為變化指標,評價DPSCs治療骨質(zhì)疏松的效果。在小鼠雙側(cè)卵巢切除后一天,經(jīng)尾靜脈注射DPSCs-HGF,給予細胞后一個月,發(fā)現(xiàn)細胞治療可顯著改善小鼠的骨量減少,其中骨小梁骨量占總空間比升高約23%,骨小梁骨密度升高約22%。與模型組相比,對照病毒Ad-Null感染的DPSCs(DPSCs-Null)治療組,骨量減少雖有緩解,但二者之間無統(tǒng)計學差異。因此我們延長了療效觀察時間,發(fā)現(xiàn)在細胞治療后6周,DPSC-Null治療組與模型組相比,其骨量減少具有統(tǒng)計學差異。基于以上實驗結(jié)果,我們認為采用DSPCs治療骨質(zhì)疏松,適宜在骨質(zhì)疏松早期進行細胞干預,且DPSC-HGF具有更好的治療骨質(zhì)疏松作用。本研究我們發(fā)現(xiàn)注射到體內(nèi)的細胞并沒有分布到骨量減少的股骨局部,表明治療效果并不是由于外源間充質(zhì)干細胞本身向骨量減少部位遷移并分化為成骨細胞,而有可能是通過間充質(zhì)干細胞的旁分泌作用來發(fā)揮炎癥抑制和促進成骨的作用。因此我們又進一步開展了DPSCs治療骨質(zhì)疏松機制的研究。我們利用Luminex多因子檢測技術,檢測了模型組及細胞治療組小鼠不同時間點血清中RANKL、OPG、IL-6和TNF-α等因子表達量的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠與假手術組正常小鼠相比,其血清中RANKL顯著增加,且OPG逐漸降低。而通過給模型小鼠進行細胞治療,能夠抑制RANKL/OPG途徑,從而減少骨質(zhì)疏松小鼠的骨量丟失。模型組小鼠與假手術組正常小鼠相比,其血清中IL-6和TNF-α表達增高,通過給模型小鼠進行細胞治療,能夠抑制IL-6和TNF-α的增高,從而在一定程度抑制骨質(zhì)疏松小鼠的炎癥反應。同時我們還分離培養(yǎng)了細胞治療6周后小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞,應用熒光定量PCR和Western Blot的方法,發(fā)現(xiàn)模型小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨相關基因及蛋白ALP、RUNX2、OC均顯著降低,經(jīng)過細胞治療后,其下降程度得到緩解。最后,考慮到DPSCs改善骨量減少的主要作用可能是通過其分泌的活性物質(zhì),因此我們又探索了DPSCs的衍生物即DPSCs來源的外泌體,并對其特性及其干預骨質(zhì)疏松的可能作用進行了研究。我們采用超速離心的方法,分離提純了DPSCs-Null和DPSCs-HGF來源的外泌體,利用透射電子顯微鏡觀察到其具有外泌體的典型形態(tài),利用粒徑分析統(tǒng)計證明外泌體的粒徑大小分布在100nm左右,利用流式細胞儀驗證了所提取外泌體具有典型的與內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運體相關的蛋白CD9、CD63和CD81,同時表達與其來源DPSC相同的表面標志,CD73、CD90、CD105表達陽性,CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR表達陰性。利用外泌體與DPSCs共培養(yǎng),驗證了其具有促進細胞向成骨分化的作用,這為后期利用外泌體治療骨質(zhì)疏松奠定了基礎。綜上所述,我們通過規(guī)范牙髓間充質(zhì)干細胞獲取、培養(yǎng)、鑒定等流程,為其作為一種細胞治療產(chǎn)品提供了可能。我們創(chuàng)新性地用HGF基因修飾DPSCs,通過增強DPSC的成骨能力和炎癥抑制作用來增強DPSCs在骨質(zhì)疏松模型中的療效,并且初步探索了DPSCs-HGF來源的外泌體對DPSCs成骨分化相關基因的影響。實驗結(jié)果提示,DPSCs發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松的作用主要是通過其分泌細胞因子,影響RANKL/OPG途徑,減少炎癥因子激活,減輕小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨能力的損害程度,最終抑制小鼠的骨量缺失。上述研究為臨床上治療骨質(zhì)疏松提供了新思路和理論基礎。
【圖文】：

圖 1 人牙髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)觀察A 為 P0 代細胞，，B 為 P3 代細胞3.2 DPSCs 表面標志物鑒定收集第 3 代 DPSCs，流式細胞儀收集數(shù)據(jù)后，通過 FlowJo7.6 軟件分析細胞免疫表型（圖 2），結(jié)果顯示，圖 2B、2C 為小鼠 IgG1 FITC、IgG1 PE 圖示。表面標志物 CD73、CD90、CD105 為陽性（圖 2D、E、F），B 淋巴細胞表面標志物 CD19（圖 2G）、造血祖細胞表面標志物 CD34（圖 2H）、單核細胞/巨噬細胞粒細胞等表面標志物 CD11b（圖 2I）、淋巴細胞表面標志物 CD45（圖 2J）、抗原提成細胞表面標志物 HLA-DR 為陰性（圖 2K）。該結(jié)果表明，從牙髓分離的細胞，經(jīng)培養(yǎng)后無造血細胞、淋巴細胞混雜，其表面標志物的表達符合間充質(zhì)干細胞的特性。

圖 2 流式細胞儀分析 DPSC 細胞表型特征析的細胞，B 圖為小鼠 IgG1 FTTC，C 圖為小鼠 E 圖為表面標志物 CD90，F(xiàn) 圖為表面標志物 CD 圖為表面標志物 CD34，I 圖為表面標志物 CD11物 CD45，K 圖為表面標志物 HLA-DR化PSCs 經(jīng)成骨誘導分化后，出現(xiàn)黑色的礦化結(jié)節(jié)
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R580;R-332

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本文編號：2644185