【摘要】：研究背景及目的:內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,EC)NF-кB信號(hào)在敗血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞坐落于由多種生物大分子組成的基底膜(basement membrane,BM)之上。盡管過往有大量文獻(xiàn)報(bào)道了基底膜各單一組分或基底膜替代物(如Matrigel)對(duì)EC生物學(xué)功能的調(diào)控作用,但這些體外基底膜研究模型在化學(xué)成分和/或物理性狀方面均與真正基底膜存在顯著差異,而來源于體內(nèi)、保存了基底膜真實(shí)性和完整性的羊膜或腸系膜基底膜體外研究模型被長期忽視,目前仍缺乏關(guān)于基底膜作為整體是否以及如何調(diào)節(jié)EC功能的研究�；诜茄仔誀顟B(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞具有完整的基底膜而炎癥狀態(tài)下的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞失去基底膜完整性這一體內(nèi)觀察結(jié)果,我們利用來源于腸系膜的基底膜體外研究模型,探討了基底膜作為一個(gè)整體調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞炎癥信號(hào)的可能性。在觀察到完整基底膜在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞NFκB炎癥信號(hào)的同時(shí)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞間粘附的結(jié)果后,我們對(duì)其分子機(jī)制展開了深入研究,并利用Lox P-Cre技術(shù)試圖建立血管選擇性的體內(nèi)基底膜基因敲除小鼠模型,為后繼體內(nèi)研究基底膜完整性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NFκB炎癥信號(hào)的調(diào)控作用提供動(dòng)物模型。研究方法:(1)從活體大鼠體內(nèi)獲取大網(wǎng)膜,制備保持基底膜完整性和真實(shí)性的基底膜模型。(2)利用蛋白免疫印跡(Western Blot)、RT-PCR、NFкB熒光素酶報(bào)道基因等技術(shù),研究NFκB信號(hào)活化程度差異及相關(guān)蛋白表達(dá)。(3)利用高鹽洗脫、激活白細(xì)胞孵育等方法破壞基底膜完整性,研究基底膜完整性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NFκB信號(hào)的影響。(4)利用重組慢病毒介導(dǎo)的sh RNA靜默VE-Cadherin表達(dá)以及不同細(xì)胞培養(yǎng)密度研究VE-Cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NFκB信號(hào)的影響。(5)利用熒光素酶報(bào)道基因與Western Blot等技術(shù)研究基底膜通過調(diào)控VECadherin表達(dá)進(jìn)而調(diào)控β-Catenin轉(zhuǎn)錄活性及β-Trcp1表達(dá)水平,從而調(diào)控IκB表達(dá)水平及NFκB信號(hào)。(6)利用GST融合蛋白下拉(pulldown)技術(shù)研究VE-Cadherin對(duì)Rho A小GTPase活性的影響,進(jìn)而利用基因點(diǎn)突變技術(shù)研究Rho A活性對(duì)NFкB活性的影響。(7)利用VE-Cadherin-Cre/Lox P技術(shù)建立血管基底膜組織特異性Laminin-γ1基因敲除小鼠品系,為研究血管基底膜完整性對(duì)NFκB信號(hào)的影響提供動(dòng)物模型。研究結(jié)果:(1)從體內(nèi)分離出來的大網(wǎng)膜基底膜組織能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞NFκB信號(hào)通路;(2)基底膜的完整性對(duì)抑制內(nèi)皮細(xì)胞NFκB信號(hào)至關(guān)重要;(3)完整基底膜通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附抑制NFκB信號(hào);(4)VE-Cadherin能夠抑制β-Catenin轉(zhuǎn)錄活性而降低β-TRCP1表達(dá),β-TRCP1調(diào)控底物IκB蛋白質(zhì)穩(wěn)定性升高,最終抑制NFκB信號(hào);(5)VE-Cadherin能夠降低Rho A活性,進(jìn)而抑制下游NFκB信號(hào)。研究結(jié)論:完整基底膜在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞NFκB信號(hào),此抑制作用通過VECadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附進(jìn)而調(diào)控β-catenin轉(zhuǎn)錄活性以及Rho A活性而實(shí)現(xiàn)。
【圖文】：

其下游的NF κB表達(dá)；另一方面VE-Cadherin抑制與其胞內(nèi)段結(jié)合的分子β-Catenin進(jìn)入胞核，減弱β-Catenin對(duì)CRD-BP的穩(wěn)定作用，導(dǎo)致β-TRCP1表達(dá)減少，使得I κBα穩(wěn)定提高，最終抑制了NF κB信號(hào)。如圖1所示。圖1基底膜調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞NF κB信號(hào)機(jī)制的猜想Figure 1 Conjecture of the basement membrane regulating the signaling mechanism of NF κB inendothelial cells

圖 3 基底膜 Transwell 培養(yǎng)示意圖Figure 3 Schematic diagram of basement membrane Transwell culture3.2.2 HUVEC 細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)HUVEC 細(xì)胞通過膠原酶消化的方式，由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供的鮮臍帶中分離而獲得。培養(yǎng)基成分為培養(yǎng)基 199（Gibco），并含 20％人血清50μg/ mL 內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充物（BDBiosciences），100U/mL 青霉素和 100μg鏈霉素成分。并用生長因子混合物刺激，包括 100 ng / mL 人血管內(nèi)皮生長因（VEGF），50 ng / mL 人肝細(xì)胞生長因子（HGF），10ng / mL 人 TGFβ，0.5mLTGFβ1 和 100μg/ mL 肝素。3.2.3 小鼠的繁殖與鑒定（1）小鼠的獲得LamC1 fl/+ 小鼠購于美國 The Jackson Laboratory，委托南京大學(xué)模式動(dòng)研究所代為進(jìn)口，該小鼠已被成功用于基底膜對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能影響的研究,品
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2642411