【摘要】：目的:胸腺是機體重要的免疫器官,是孵育T淋巴細胞成熟的場所,來自骨髓的淋巴造血祖細胞(lymphohematopoietic progenitor cell,LPC)經(jīng)過血液循環(huán)進入胸腺,與胸腺微環(huán)境相互作用并逐步向成熟的T淋巴細胞發(fā)育,最終經(jīng)胸腺移行到外周的免疫器官并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。胸腺在青春期時重量達到最大,隨后便開始發(fā)生增齡性萎縮,是機體最早發(fā)生衰老的器官,胸腺老化主要表現(xiàn)為明顯的萎縮,以腺體變小,重量減低,細胞結(jié)構(gòu)破壞和脂肪細胞的積累為特征。胸腺增齡性萎縮會引起免疫系統(tǒng)衰老和應(yīng)答免疫系統(tǒng)功能低下,進而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生、增加機體罹患癌癥及感染性疾病的危險。近些年的研究表明,許多老年人常見的疾病,如糖尿病、心血管疾病等也可能與胸腺功能減退導(dǎo)致的免疫功能下降相關(guān)。胸腺基質(zhì)細胞是胸腺微環(huán)境的主要組成部分,包含胸腺上皮細胞(thymus epithelial cell,TEC)、成纖維細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(deutrtic cell,DC)等,有研究表明,胸腺內(nèi)的脂肪細胞主要是由成纖維細胞分化發(fā)育而來,然而胸腺內(nèi)的成纖維細胞向脂肪細胞分化發(fā)育的機制卻并不清楚。因此研究胸腺脂肪化的分子機制,為進一步探究胸腺的發(fā)育和萎縮的分子機制,對提高機體免疫力、延緩免疫系統(tǒng)衰老至關(guān)重要。研究方法:1、原代胸腺基質(zhì)細胞的培養(yǎng)及鑒定:選取出生3天內(nèi)的小鼠胸腺,利用酶消化方法提取原代的小鼠胸腺基質(zhì)細胞(thymic stromal cell,TSC),流式細胞術(shù)及細胞免疫熒光染色檢測細胞的表型。使用過氧化物酶體增殖激活物受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)的激動劑羅格列酮,誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的TSCs分化成為脂肪細胞,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)處理的細胞作為對照,油紅O染色檢測脂滴的形成情況,Real-time PCR檢測成脂相關(guān)基因PPARγ、FABP4(fatty acid binding protein 4)的mRNA表達水平。2、TSCs向脂肪細胞分化過程中差異表達lncRNA和mRNA的篩選:DMSO組及羅格列酮誘導(dǎo)組各取三組樣本,采用高通量測序技術(shù)(High-throughput Sequencing),以篩選的閾值為qvalue0.05(若qvalue0.05篩選差異基因過少則使用pvalue0.05進行差異篩選)作為篩選TSCs向脂肪細胞分化過程中差異表達的lncRNA和mRNA標(biāo)準(zhǔn),并對篩選后差異表達的lncRNA和mRNA進行非監(jiān)督層次聚類分析、GO分析(gene ontology,GO)和KEGG分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes),使用Real-time PCR驗證所篩選出的與成脂相關(guān)基因的表達變化。3、Notch信號通路在TSCs向脂肪細胞分化過程中的作用:使用Real-time PCR檢測在羅格列酮將TSCs誘導(dǎo)分化成為脂肪細胞的過程中Notch信號通路受體(Notch1~4)、配體(DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2)及下游靶基因(Hes1、Hey1)的表達變化,隨后過表達或抑制Notch1,油紅O染色和Adipored染色觀察脂滴的形成,Real-time PCR檢測PPARγ、FABP4的mRNA表達水平。4、Notch信號通路與自噬共同調(diào)節(jié)TSCs的脂肪化:Western blot檢測羅格列酮誘導(dǎo)TSCs后0、1、3、5、7天時自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的蛋白表達水平。Western blot檢測不同濃度的Notch信號通路抑制劑DAPT(0、1、2、5、10μm)處理TSCs后自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及自噬相關(guān)通路p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表達水平。在羅格列酮誘導(dǎo)TSCs的過程中同時使用Notch信號通路抑制劑DAPT及自噬抑制劑3-MA,油紅O染色和Adipored染色觀察脂滴的形成情況,Real-time PCR檢測PPARγ、FABP4的mRNA表達水平。結(jié)果:1、原代TSCs的提取與鑒定:提取的原代TSCs大多數(shù)呈成纖維細胞樣,流式細胞術(shù)結(jié)果顯示約97%的細胞呈CD45~-S100A4~+表型,細胞免疫熒光結(jié)果也顯示多數(shù)的細胞呈S100A4~+表型,說明多數(shù)的TSCs為成纖維細胞;2、羅格列酮誘導(dǎo)原代TSCs向脂肪細胞分化:分別用DMSO和10μm羅格列酮對TSCs進行處理,(1)油紅O染色結(jié)果DMSO對照組中并無脂滴形成,而羅格列酮處理組有大量的脂滴出現(xiàn);(2)Real-time PCR檢測脂肪形成相關(guān)基因PPARγ與FABP4的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)羅格列酮誘導(dǎo)組中,兩個基因的表達較對照組明顯增高;3、篩選TSCs向脂肪細胞轉(zhuǎn)分化過程中差異表達的lncRNA及mRNA:(1)高通量測序一共篩選出1737個差異表達的mRNA(965個上調(diào)和772個下調(diào))、45個差異表達的lncRNA(29個上調(diào)和16個下調(diào))和31個差異表達的不確定編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本(transcripts of uncertain coding potential,TUCP)(14個上調(diào)和17個下調(diào));(2)利用非監(jiān)督層次聚類的方法對差異表達基因進行分析,分別使用差異表達的lncRNA、TUCP的靶基因和mRNA產(chǎn)生熱圖,它們清楚地被分離成Rosi和對照簇,同組樣本聚在同一簇中;(3)GO顯著性富集分析結(jié)果顯示篩選得到的差異基因無論是mRNA、lncRNA還是TUCP都主要是在細胞代謝、有機物質(zhì)代謝、氮化合物代謝等過程中顯著富集;(4)篩選得到的差異mRNA在PPARγ、胰島素、環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)及泛素化介導(dǎo)的蛋白水解相關(guān)的信號通路發(fā)生顯著富集,篩選到的差異lncRNA主要在絲裂原活化蛋白激酶(Mtogen-activated protein kinase,MAPK)、泛素化蛋白水解、過氧化物等信號通路發(fā)生顯著富集,篩選到的差異TUCP在癌癥、神經(jīng)營養(yǎng)因子等信號通路發(fā)生顯著富集;4、Notch信號通路在TSCs脂肪化中的作用:(1)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示在TSCs向脂肪細胞分化過程中Notch信號通路的受體Notch1、配體Jagged1及靶基因Hey1的表達下降,而配體DLL1的表達升高;(2)構(gòu)建攜帶Notch1基因的腺病毒,并轉(zhuǎn)入TSCs中,Western Blot結(jié)果顯示Notch1過表達后,胞漿內(nèi)Notch1及胞核內(nèi)Notch1活化片段N1ICD的蛋白水平表達升高,Real-time PCR結(jié)果顯示Notch信號通路下游靶基因Hey1的表達升高;(3)對過表達Notch1基因的TSCs進行羅格列酮誘導(dǎo),油紅O染色和AdipoRed染色結(jié)果顯示脂肪滴的形成受到抑制。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示成脂相關(guān)基因FABP4的mRNA表達水平出現(xiàn)下降;(4)DAPT和si-Notch1作用于TSCs,胞漿內(nèi)Notch1及胞核中N1ICD的蛋白水平下降,同時Notch信號通路的下游靶基因Hey1的mRNA水平也出現(xiàn)下降;(5)DAPT和si-Notch1抑制Notch信號通路的同時添加羅格列酮誘導(dǎo)TSCs向脂肪細胞分化,油紅O染色和AdipoRed染色結(jié)果顯示脂肪滴的形成增多,成脂相關(guān)因子PPARγ及FABP4的mRNA表達水平在抑制Notch信號通路后表達出現(xiàn)上升;5:Notch信號通路與自噬共同調(diào)節(jié)TSCs向脂肪細胞分化:(1)分別在羅格列酮處理TSCs后的第0、1、3、5、7天收集細胞并提取蛋白,western blot實驗結(jié)果顯示自噬相關(guān)指標(biāo)LC3、Becline1蛋白水平無明顯變化,p62的蛋白表達水平降低;(2)用不同濃度的DAPT(0、1、2、5、10μm)對TSCs進行處理,48h后收集細胞并提取蛋白,western blot實驗結(jié)果顯示自噬相關(guān)指標(biāo)LC3-II/LC3-I隨DAPT濃度的增高而呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢,p62蛋白水平出現(xiàn)了降低,p-AKT/AKT與p-mTOR/mTOR的蛋白表達水平降低;(3)添加自噬的抑制劑3-MA,同時添加或不添加Notch信號通路抑制劑DAPT,油紅O染色和AdipoRed染色結(jié)果顯示使用3-MA抑制自噬后脂肪滴的形成減少,同時還可以部分逆轉(zhuǎn)DAPT導(dǎo)致的脂肪滴形成的增加,在DAPT處理TSCs的同時添加了3-MA,PPARγ及FABP4的表達較單獨使用DAPT組下降。結(jié)論:1、在羅格列酮誘導(dǎo)的TSCs向脂肪細胞分化過程中有1737個mRNA(965個上調(diào)和772個下調(diào))、45個lncRNA(29個上調(diào)和16個下調(diào))和31個TUCP(14個上調(diào)和17個下調(diào))表達發(fā)生明顯的改變;2、調(diào)節(jié)Notch信號通路水平可以影響TSCs向脂肪細胞分化的過程;3、抑制Notch信號通路可通過提高自噬水平來促進TSCs向脂肪細胞的分化。
【圖文】：

3.1 原代 TSCs 的提取與鑒定首先，我們根據(jù)已有文獻報道的酶消化方法進行原代 TSCs 的提取，從細胞形態(tài)看，大多數(shù)的TSCs呈成纖維細胞樣(圖3.1A)。S100A4(S100 calcium binding proteinA4)又稱 FSP1，是成纖維細胞的特異性標(biāo)志物，在經(jīng)過 2 次傳代后，我們對所提取的細胞應(yīng)用流式細胞術(shù)進行鑒定，如圖所示約 97%的細胞呈 CD45-S100A4+表型(圖3.1B)，細胞免疫熒光結(jié)果也顯示多數(shù)的細胞呈 S100A4+表型(圖 3.1C)，說明經(jīng)過傳代后，胸腺細胞已被篩除，而剩余的 TSCs 多數(shù)為成纖維細胞，我們的結(jié)果與之前Yang 等的結(jié)果一致

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.2 羅格列酮誘導(dǎo)原代 TSCs 向脂肪細胞分化油紅 O 為一種脂溶性的染料，，在脂肪內(nèi)能高度的溶解，可特異性的使組織或細胞內(nèi)的甘油三酯著色，是檢測脂滴形成的經(jīng)典實驗方法。我們分別用 DMSO 和 10μM 羅格列酮對 TSCs 進行處理，7 天后，利用油紅 O 染色檢測脂滴形成情況，從圖中可以看出，DMSO 對照組中并無脂滴形成，而羅格列酮處理組有大量的脂滴出現(xiàn)(圖 3.2A)，同時，我們檢測了脂肪形成相關(guān)基因 PPARγ 與 FABP4 的 mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)羅格列酮誘導(dǎo)組中，兩個基因的表達明顯較 DMSO 處理組高(圖 3.2B)。以上結(jié)果均說明 TSCs 可以被羅格列酮誘導(dǎo)向脂肪細胞分化。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張一鳴;譚曉開;王銘遠;李呼倫;;調(diào)節(jié)性B細胞與自身免疫性疾病[J];國際免疫學(xué)雜志;2017年02期

2 賈佳;鄭凱;;耐受性樹突狀細胞在自身免疫中的作用[J];國際免疫學(xué)雜志;2017年01期

本文編號：2630162