發(fā)布時間：2020-04-14 03:50

【摘要】：目的:對比LL-37、HNP1、HNP3、HBD2、HBD4對沙眼衣原體的IC50;檢測體外原核表達(dá)的衣原體高溫需要A蛋白(cHtrA)酶切上述5種抗菌肽的能力;檢測內(nèi)源性cHtrA酶切LL-37的能力;檢測外源性cHtrA及其突變型(MT-H143A和MT-S247A)抑制LL-37殺傷沙眼衣原體L2型、D型、鼠肺炎株(MoPn)的能力。方法:體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞,以2.0?10~5/ml的細(xì)胞濃度接種至24孔板內(nèi),待細(xì)胞密度增長至90%時接種與5種抗菌肽共孵育過的沙眼衣原體L2型菌株,37℃溫箱培養(yǎng),利用間接免疫熒光對5種抗菌肽進(jìn)行IC50滴定;將5種100μg/ml的抗菌肽分別與0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml四種濃度的外源性cHtrA以及兩種100μg/ml的突變型cHtrA MT-H143A和cHtrA MT-S247A在37℃孵箱中孵育30分鐘,經(jīng)SDS-PAGE跑膠后用Western Blot檢測cHtrA與抗菌肽之間的相互作用結(jié)果;沙眼衣原體L2型菌株感染HeLa細(xì)胞后提取其細(xì)胞胞漿(L2S100),并以免疫共沉淀的原理,通過谷胱甘肽蛋白珠提取L2 S100中的內(nèi)源性cHtrA,使不同量的內(nèi)源性cHtrA與LL-37共孵育后,經(jīng)SDS-PAGE跑膠后用Western Blot檢測內(nèi)源性cHtrA對LL-37的酶切作用;將LL-37與不同濃度的外源性cHtrA以及2種突變型cHtrA MT-H143A和MT-S247A在37℃孵箱中共孵育30min,每組再與沙眼衣原體L2型菌株、D型菌株和鼠肺炎株(MoPn)在室溫下共孵育2h,經(jīng)感染HeLa細(xì)胞后用免疫熒光檢測菌株的感染率;每個蓋玻片計數(shù)5個隨機視圖,并求其平均值來定量衣原體感染,結(jié)果表示為每個視圖的包涵體形成單位(inclusion forming units,IFUs)的數(shù)量,基于所設(shè)定的每種抗菌肽的濃度梯度,及該濃度下所觀察到的IFUs,利用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,可得出每種抗菌肽的50%抑制濃度,感染率用(IFUs/細(xì)胞數(shù)量)表示,每組設(shè)置三個相同實驗條件的孔同時操作以減少實驗誤差,經(jīng)過重復(fù)計數(shù)及計算,最終感染率表示為(平均值?標(biāo)準(zhǔn)差)。結(jié)果:5種人體抗菌肽之中LL-37的抗衣原體作用最強(IC50=4.62?0.94μg/ml;平均值?標(biāo)準(zhǔn)差),其次為HBD2(IC50=28.33?9.45μg/ml),HBD4(IC50=47.7?6.15μg/ml),HNP1(IC50=60.67?5.13μg/ml),HNP3(IC50=69.87?7.45μg/ml)。無論內(nèi)外源性,10μg/ml cHtrA可以顯著且特異的酶切LL-37,而對HNP1,HNP3,HBD2和HBD4毫無影響,100μg/ml的cHtrA可以完全酶切100μg/ml的LL-37底物,兩種突變型cHtrA MT-H143A和MT-S247A則失去了該作用�？瞻讓φ战M的HeLa細(xì)胞沙眼衣原體L2型感染率為(54%?6.24%),加入30μg/ml LL-37時衣原體感染率為(7.67%?2.08%),而加入1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml cHtrA時感染率分別為(11.3%?3.51%)、(28.7%?7.51%)、(44.7%?5.13%),僅加入cHtrA未加入LL-37時(47%?6.24%),分別加入cHtrA突變型MT-H143A和MT-S247A時感染率為(10%?3%)、(8.67%?3.06%)。對沙眼衣原體D型、鼠肺炎株(MoPn)進(jìn)行的實驗表現(xiàn)出一致性,且cHtrA濃度加至10μg/ml時感染率均與僅加入LL-37組表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(均有P0.05),兩種突變型cHtrA對于對抗LL-37的作用沒有意義。結(jié)論:LL-37在本試驗的五種抗菌肽中表現(xiàn)出了最強效的抗衣原體作用,但無論內(nèi)源性還是外源性cHtrA均具有酶切LL-37的能力。無論是在沙眼衣原體L2型、D型、還是鼠肺炎株(MoPn),cHtrA均強效抑制LL-37對沙眼衣原體的殺傷作用,該作用隨著cHtrA的濃度梯度而逐步增強。這證明了cHtrA在沙眼衣原體感染過程中通過酶切LL-37表現(xiàn)出的正向保護(hù)作用。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文驗中證明具有最強抗衣原體作用的 Cathelicidin 家族的 LL-37 受到了 cHtrA 特異性的反擊。而本實驗設(shè)置的兩組突變型 cHtrA 卻均不具備酶切任意一種抗菌肽的能力，因此我們推測，cHtrA 對 LL-37 的酶切作用并非單單是由其某個基團(tuán)完成的，而是 cHtrA 本身具有此種酶切能力。（見圖 2.1）

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文后 cHtrA 出現(xiàn)強表達(dá)帶，而 LL-37 的條帶很弱，與加入 15μl提純的 cHtrA 時條帶深淺相當(dāng)。當(dāng) LL-37 中加入粘附有 cHtrA 的谷胱甘肽蛋白珠共孵育后，依照濃度梯度（5μl、15μl、45μl）cHtrA 的條帶逐步增強，LL-37 的條帶依次減弱直至幾乎完全消失（見圖 2.2）。此實驗進(jìn)一步驗證了 2.2.1 中“cHtrA 可以有效酶切 LL-37”的結(jié)論，證明了含有 cHtrA 的細(xì)胞胞漿與從中提純的內(nèi)源性 cHtrA 均可隨著濃度的增加而愈發(fā)有效的酶切抗菌肽 LL-37。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R374

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳源;;吃什么食物對支原體感染有好處[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2017年18期

2 劉全忠;;沙眼衣原體持續(xù)感染的診斷和治療[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2013年06期

3 張健;關(guān)琪;;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測沙眼衣原體基因[J];中國基層醫(yī)藥;2007年08期

4 江萍;周宜蘭;;聚合酶鏈反應(yīng)檢測淚液中沙眼衣原體的臨床研究[J];眼科新進(jìn)展;2006年04期

5 高省,陳祥生;沙眼衣原體分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2004年06期

6 吳年浪,張惠成;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測沙眼衣原體[J];眼科研究;2003年01期

7 謝林森,李莉;PCR法和EIA法檢測沙眼衣原體的比較[J];實用醫(yī)技雜志;2002年12期

8 鐘慧萍;沙眼衣原體509例檢測結(jié)果分析[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;2001年03期

9 陳繼英;謹(jǐn)防沙眼衣原體“性騷擾”[J];醫(yī)藥世界;2000年04期

10 孫明喜,于素云,劉建亭;沙眼衣原體檢查及其臨床應(yīng)用[J];遼寧醫(yī)學(xué)雜志;1998年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉全中;楊士強;傅志宜;王樹椿;繳穩(wěn)玲;田靜群;;遷延難愈沙眼衣原體泌尿生殖道感染——幾種抗生素的療效評定和隨訪[A];2002中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2002年

2 董海榮;;沙眼衣原體的研究進(jìn)展[A];第四屆中國臨床微生物學(xué)大會暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2013年

3 江勇;楊麗娜;劉原君;劉全忠;;沙眼衣原體培養(yǎng)過程中耐甲氧西林表皮葡萄球菌污染的防控[A];中華醫(yī)學(xué)會第16次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會摘要集[C];2010年

4 劉全忠;;沙眼衣原體治療現(xiàn)況和噬菌體的研究進(jìn)展[A];中華醫(yī)學(xué)會第16次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會摘要集[C];2010年

5 朱慧玲;李紅梅;張勤奮;陳木開;韓建德;;沙眼衣原體持續(xù)感染模型及快速鑒定方法的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十八次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2012年

6 肖萌;劉全忠;;沙眼衣原體免疫優(yōu)勢蛋白的研究進(jìn)展[A];中華醫(yī)學(xué)會第十八次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2012年

7 劉原君;齊蔓莉;紹麗麗;盛彩虹;姚衛(wèi)鋒;侯淑萍;劉全忠;;沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)株不同型之間的差異性探討[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

8 楊斌;鄭和平;薛耀華;吳興中;江漢寧;黃進(jìn)梅;;廣州地區(qū)泌尿生殖道沙眼衣原體基因分型研究[A];2010全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

9 劉全忠;江勇;侯淑萍;邵麗麗;楊曉靜;楊麗娜;;遷延難愈沙眼衣原體泌尿生殖系感染的臨床與實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

10 邵麗麗;江勇;楊麗娜;楊曉靜;劉原君;劉全忠;;299例泌尿生殖道沙眼衣原體的檢測及藥物敏感性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 凹凸;沙眼衣原體可致不孕[N];大眾衛(wèi)生報;2001年

2 柯春榮;沙眼衣原體可導(dǎo)致不孕[N];大眾衛(wèi)生報;2003年

3 江錦琦;女性感染沙眼衣原體可致不孕[N];中國中醫(yī)藥報;2001年

4 常怡勇;陰道炎 要根據(jù)白帶異常來用藥[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

5 韓莉;“沙眼衣原體”也會入侵生殖系統(tǒng)[N];中國人口報;2006年

6 鄧啟泰;“沙眼衣原體”個頭小危害大[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2006年

7 北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科主任醫(yī)師 劉朝暉;有些不孕、宮外孕禍起沙眼衣原體[N];光明日報;2015年

8 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院主任醫(yī)師 劉志剛;生殖器也會感染沙眼衣原體[N];家庭醫(yī)生報;2016年

9 汪濤;孕婦感染沙眼衣原體危害大[N];大眾衛(wèi)生報;2007年

10 于泓珍;淋球菌與沙眼衣原體引起的感染[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 魏世娟;重組噬菌體對沙眼衣原體作用及機制的探索[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

2 任杰;衣原體噬菌體CPG1衣殼蛋白Vp1對沙眼衣原體抑制作用機制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

3 郭宣誠;cGAS與RIG-Ⅰ介導(dǎo)沙眼衣原體天然免疫應(yīng)答作用機制研究[D];南京大學(xué);2015年

4 王千秋;泌尿生殖道沙眼衣原體感染的某些血清學(xué)和分子生物學(xué)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1997年

5 尚淑賢;沙眼衣原體藥物敏感性試驗方法的建立及其臨床意義的初步探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

6 白光春;沙眼衣原體重組口服活疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)特性的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1999年

7 李元;沙眼衣原體18KDa粘連蛋白的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1995年

8 李燕;沙眼衣原體Pmp蛋白的表達(dá)純化及其臨床檢測的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2007年

9 高省;女性高危人群生殖道沙眼衣原體感染的分子流行病學(xué)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

10 江勇;沙眼衣原體臨床株體外藥物敏感性與耐藥機制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張晚星;衣原體分泌蛋白cHtrA抑制LL-37抗衣原體活性的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

2 張穎;鼠肺炎沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pgp5的生物學(xué)特性分析及其調(diào)控基因表達(dá)的機制初探[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

3 欒秀麗;沙眼衣原體假定功能蛋白CT036的定位及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];南華大學(xué);2019年

4 孫豫輝;沙眼衣原體GlgA蛋白分泌機制初探及相互作用蛋白的篩選[D];南華大學(xué);2018年

5 錢后;沙眼衣原體CT849蛋白激活JNK/ERK信號通路誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子[D];南華大學(xué);2018年

6 趙天威;人血清維生素D與泌尿生殖道沙眼衣原體感染的關(guān)系初探[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

7 肖麗國;沙眼衣原體及其Ⅲ型分泌系統(tǒng)電子顯微學(xué)研究[D];中山大學(xué);2018年

8 黃敏;八正散單味中藥及大黃與黃柏提取物體外抗沙眼衣原體活性研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2013年

9 孫利華;沙眼衣原體F血清型感染孕鼠導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局及致病機理的初步研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2009年

10 惠春;L_2型沙眼衣原體主要外膜蛋白基因克隆及表達(dá)[D];沈陽藥科大學(xué);2002年

，

本文編號：2626839