【摘要】：目的:基于Cre/LoxP系統(tǒng)建立出生后小鼠軟骨組織特異性Ihh基因敲除模型,觀察其表型變化差異,并從分子層面探討條件性敲除Ihh基因后小鼠軟骨生長(zhǎng)板異常骨化的相關(guān)機(jī)制,為諸如Jensen干骺端發(fā)育不良、Laron綜合征、骨質(zhì)疏松、人類Ihh基因突變導(dǎo)致的A1型短指癥等疾病的發(fā)病機(jī)理提供治療的新思路。方法:(1)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)剛出生小鼠進(jìn)行基因鑒定,篩選適合的基因型小鼠并通過(guò)腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen TM)實(shí)現(xiàn)Ihh條件性基因敲除。通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證Ihh基因的敲除率。(2)對(duì)8周齡小鼠大體形態(tài)進(jìn)行觀察并記錄,拍攝全身及后肢X線片,利用Micro-CT對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)行斷層掃描并三維重建,觀察其骨質(zhì)疏松程度;選取6d、8d、10d、12d小鼠膝關(guān)節(jié)行番紅固綠染色、Von Kossa染色進(jìn)行軟骨生長(zhǎng)板動(dòng)態(tài)演變觀察。(3)選擇出生后第6天小鼠肋軟骨細(xì)胞提取并體外培養(yǎng),流式細(xì)胞學(xué)法探討軟骨生長(zhǎng)板異常骨化原因,RT-qPCR檢測(cè)圍繞Ihh-PTHrP信號(hào)軸相關(guān)信號(hào)因子的表達(dá)并運(yùn)用細(xì)胞營(yíng)救實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,以此解析下游相關(guān)基因。結(jié)果:(1)通過(guò)RT-qPCR證實(shí)了Ihh條件性基因敲除率為76.83%。(2)8周齡小鼠大體形態(tài)表現(xiàn)為肢體短小畸形,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),實(shí)驗(yàn)組小鼠存在著明顯的骨質(zhì)疏松(P0.05),X線及Micro-CT三維重建顯示敲除小鼠股骨、脛骨明顯縮短且骨骺端發(fā)育異常;番紅固綠染色顯示Ihh條件性敲除表達(dá)在發(fā)育中的小鼠脛骨生長(zhǎng)板軟骨組織這一特定區(qū)域,Von Kossa染色顯示Ihh~(d/d)小鼠生長(zhǎng)板提前出現(xiàn)骨化并且骨骺過(guò)早閉合。(3)凋亡實(shí)驗(yàn)表明兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);RT-qPCR表明,條件性敲除Ihh后,PTHrP表達(dá)量降低(P0.05),BMP-6表達(dá)明顯升高(P0.05),RunX-2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);細(xì)胞營(yíng)救實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了這一結(jié)果。結(jié)論:Ihh基因?qū)S持小鼠生長(zhǎng)板區(qū)軟骨細(xì)胞的有序分區(qū)及程序化分化有著相當(dāng)重要的作用,Ihh條件性基因敲除后導(dǎo)致小鼠生長(zhǎng)板區(qū)軟骨細(xì)胞分化無(wú)序,分區(qū)紊亂,生長(zhǎng)板區(qū)軟骨細(xì)胞提前骨化,骨骺生長(zhǎng)板過(guò)早骨化閉合,小鼠表現(xiàn)為肢體短小畸形并伴有明顯的骨質(zhì)疏松;圍繞Ihh-PTHrP信號(hào)軸,Ihh的敲除抑制了其下游基因PTHrP的表達(dá)卻促進(jìn)了BMP-6表達(dá),暫未發(fā)現(xiàn)與RunX-2信號(hào)因子相關(guān)關(guān)系。
【圖文】：

圖 2.1 基因型小鼠瓊脂糖凝膠電泳鑒定1 號(hào)小鼠不含 Cre 基因，Ihh 為野生型雜合子；2 號(hào)小鼠不含 Cre，Ihh 為純合子；3 號(hào)小鼠基因，Ihh 為純合子，可作為實(shí)驗(yàn)小鼠；4 號(hào)小鼠含 Cre 基因，Ihh 為野生型雜合子。2.2 通過(guò) RT-qPCR 檢測(cè)到 Ihh 基因的敲除率RT-qPCR 結(jié)果顯示，，Ihh 的基因敲除率為 76.83%。如圖 2.2 所示。

圖 2.1 基因型小鼠瓊脂糖凝膠電泳鑒定因，Ihh 為野生型雜合子；2 號(hào)小鼠不含 Cre，Ihh 為純合子合子，可作為實(shí)驗(yàn)小鼠；4 號(hào)小鼠含 Cre 基因，Ihh 為野CR 檢測(cè)到 Ihh 基因的敲除率顯示，Ihh 的基因敲除率為 76.83%。如圖 2.2 所示
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R-332;R722.1

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本文編號(hào)：2617119