發(fā)布時間：2020-04-06 23:07

【摘要】：目的:基于Cre/LoxP系統(tǒng)建立出生后小鼠軟骨組織特異性Ihh基因敲除模型,觀察其表型變化差異,并從分子層面探討條件性敲除Ihh基因后小鼠軟骨生長板異常骨化的相關機制,為諸如Jensen干骺端發(fā)育不良、Laron綜合征、骨質疏松、人類Ihh基因突變導致的A1型短指癥等疾病的發(fā)病機理提供治療的新思路。方法:(1)通過瓊脂糖凝膠電泳對剛出生小鼠進行基因鑒定,篩選適合的基因型小鼠并通過腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen TM)實現(xiàn)Ihh條件性基因敲除。通過RT-qPCR驗證Ihh基因的敲除率。(2)對8周齡小鼠大體形態(tài)進行觀察并記錄,拍攝全身及后肢X線片,利用Micro-CT對小鼠膝關節(jié)行斷層掃描并三維重建,觀察其骨質疏松程度;選取6d、8d、10d、12d小鼠膝關節(jié)行番紅固綠染色、Von Kossa染色進行軟骨生長板動態(tài)演變觀察。(3)選擇出生后第6天小鼠肋軟骨細胞提取并體外培養(yǎng),流式細胞學法探討軟骨生長板異常骨化原因,RT-qPCR檢測圍繞Ihh-PTHrP信號軸相關信號因子的表達并運用細胞營救實驗進行驗證,以此解析下游相關基因。結果:(1)通過RT-qPCR證實了Ihh條件性基因敲除率為76.83%。(2)8周齡小鼠大體形態(tài)表現(xiàn)為肢體短小畸形,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),實驗組小鼠存在著明顯的骨質疏松(P0.05),X線及Micro-CT三維重建顯示敲除小鼠股骨、脛骨明顯縮短且骨骺端發(fā)育異常;番紅固綠染色顯示Ihh條件性敲除表達在發(fā)育中的小鼠脛骨生長板軟骨組織這一特定區(qū)域,Von Kossa染色顯示Ihh~(d/d)小鼠生長板提前出現(xiàn)骨化并且骨骺過早閉合。(3)凋亡實驗表明兩組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);RT-qPCR表明,條件性敲除Ihh后,PTHrP表達量降低(P0.05),BMP-6表達明顯升高(P0.05),RunX-2的表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞營救實驗同時驗證了這一結果。結論:Ihh基因對維持小鼠生長板區(qū)軟骨細胞的有序分區(qū)及程序化分化有著相當重要的作用,Ihh條件性基因敲除后導致小鼠生長板區(qū)軟骨細胞分化無序,分區(qū)紊亂,生長板區(qū)軟骨細胞提前骨化,骨骺生長板過早骨化閉合,小鼠表現(xiàn)為肢體短小畸形并伴有明顯的骨質疏松;圍繞Ihh-PTHrP信號軸,Ihh的敲除抑制了其下游基因PTHrP的表達卻促進了BMP-6表達,暫未發(fā)現(xiàn)與RunX-2信號因子相關關系。
【圖文】：

圖 2.1 基因型小鼠瓊脂糖凝膠電泳鑒定1 號小鼠不含 Cre 基因，Ihh 為野生型雜合子；2 號小鼠不含 Cre，Ihh 為純合子；3 號小鼠基因，Ihh 為純合子，可作為實驗小鼠；4 號小鼠含 Cre 基因，Ihh 為野生型雜合子。2.2 通過 RT-qPCR 檢測到 Ihh 基因的敲除率RT-qPCR 結果顯示，，Ihh 的基因敲除率為 76.83%。如圖 2.2 所示。

圖 2.1 基因型小鼠瓊脂糖凝膠電泳鑒定因，Ihh 為野生型雜合子；2 號小鼠不含 Cre，Ihh 為純合子合子，可作為實驗小鼠；4 號小鼠含 Cre 基因，Ihh 為野CR 檢測到 Ihh 基因的敲除率顯示，Ihh 的基因敲除率為 76.83%。如圖 2.2 所示
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R-332;R722.1

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