【摘要】：目的:潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性,自發(fā)性炎癥性腸病,病變部位累及直腸及結腸黏膜。UC病變范圍廣泛、病情反復發(fā)作、治療效果欠佳、癌變可能性大,已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治疾病之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素,特別是腸道微生物以及遺傳和免疫因素等可能是潰瘍性結腸炎發(fā)病的關鍵病理因素,并且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調與潰瘍性結腸炎的發(fā)生有著密切關系。嘎日迪散是蒙醫(yī)用于治療UC的經(jīng)典方劑,其治療效果好,復發(fā)率低。前期研究發(fā)現(xiàn)嘎日迪散對UC模型具有較好的治療效果,為進一步探討蒙藥嘎日迪散治療UC的可能作用機制以及UC模型小鼠腸道內環(huán)境菌群變化特點,本研究結合現(xiàn)代醫(yī)學對UC的最新研究進展和最近研究結果,擬以腸道內環(huán)境菌群為靶點,采用高通量測序技術結合生物信息學分析研究DSS誘導的UC模型小鼠腸道內環(huán)境菌群失衡特征以及嘎日迪散對失衡菌群的調節(jié)作用。方法:采用DSS循環(huán)自由飲水法復制UC小鼠模型,無菌條件下對小鼠結腸組織進行取材。取材后對空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、補脾益腸丸組及嘎日迪散組小鼠結腸外黏液層、內黏液層及腸道內容物菌群進行總DNA提取,之后擴增菌群16SrRNA基因V3+V4區(qū)序列并純化PCR產物,然后進行高通量測序,測序后對OTUs進行聚類、物種注釋及多樣性分析。通過MetaStat、LefSe、多元方差分析和空間統(tǒng)計學等統(tǒng)計分析方法分析分組樣品的物種組成和群落結構差異性。結果:1.通過對空白組和UC模型組結腸內容物菌群分析,得到與UC相關差異菌共141個,對141個差異菌進一步進行貝葉斯因果關系分析,發(fā)現(xiàn)與U C存在直接作用關系的菌群共有3種,分別屬擬桿菌科S24-7,Anaerotrunc us屬,瘤胃球菌科,當UC發(fā)生時會引起Anaerotruncus屬豐度顯著增加,而擬桿菌科S24-7、瘤胃球菌科豐度減少時會促進UC的發(fā)生。2.將柳氮磺吡啶組-模型組24個差異OTU與空白組-模型組內容物141個差異OTU進行比對,篩選得到10個共同差異菌,分別屬消化鏈球菌科、羅氏菌屬、肉毒桿菌屬sensu_stricto_1、毛螺球菌科、瘤胃菌科、海旋菌屬、Blautia屬、Alistipes_sp._AP11。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)柳氮磺吡啶可直接影響腸道內容物中Alistipes種AP11來發(fā)揮對UC的治療作用,Alistipes種AP11除對UC存在直接影響外,可直接作用于其下游消化鏈球菌科,而消化鏈球菌科最終通過其下游毛螺菌科對UC產生間接作用關系。3.將補脾益腸丸組-模型組16個差異OTU與空白組-模型組內容物141個差異OTU進行比對,篩選得到8個共同差異菌,分別屬毛螺菌科、Hold emania_filiformis_DSM_12042 種、克里斯滕森菌科、Alistipes_sp._AP11 種。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)補脾益腸丸、共同差異菌及UC三者不存在直接作用關系,即補脾益腸丸對UC模型小鼠腸道內容物菌群具有一定的調節(jié)作用,但其對UC治療作用機制與腸道內容物菌群調節(jié)無關。4.將嘎日迪散組-模型組10個差異OTU與空白組-模型組內容物141個差異OTU進行比對,得到5個相同差異OTU,分別屬毛螺菌科、Blautia屬、Alistipes_sp._AP11種。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)嘎日迪嘎日迪可通過直接影響毛螺菌科細菌來發(fā)揮對UC的治療作用。5.空白組,模型組結腸內容物,外黏液層,內黏液層組間菌群多樣性有顯著差異,且組間差異大于組內差異;相同分類水平細菌組間豐度存在一定差異。UC與OTU各層豐度多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學差異O TU主要分布部位為外黏液層,差異OTU注釋主要分類為Clostridiales目中的 Lachnospiraceae 科和 Ruminococcaceae 科。6.將柳氮磺吡啶組-模型組外黏液層26個差異OTU與空白組-模型組外黏液層204個差異OTU進行比對,得到9個相同差異OTU,分別屬瘤胃球菌屬、Erysipelotrichacea 科、Clostridium_sensu_stricto_1 屬、毛螺菌科、擬桿菌屬、腸桿菌科、Acetatifactor屬。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)柳氮磺吡啶、外黏液層差異OTU及UC三者不存在直接作用關系,即柳氮磺吡啶對UC模型小鼠腸道外黏液層菌群具有一定的調節(jié)作用,但并未經(jīng)外黏液層菌群調節(jié)途徑發(fā)揮對UC治療作用。7.將柳氮磺吡啶組-模型組內黏液層26個差異OTU與空白組-模型組內黏液層110個差異OTU進行比對,得到2個相同差異OTU,分別為梭菌目vadinBB60科、瘤胃菌科。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)柳氮磺吡啶、內黏液層差異OTUs及UC三者不存在直接作用關系,即柳氮磺吡啶對UC模型小鼠腸道內黏液層菌群具有一定的調節(jié)作用,但并未經(jīng)內黏液層菌群調節(jié)途徑發(fā)揮對UC治療作用。8.將補脾益腸丸組-模型組外黏液層7個差異OTU與空白組-模型組外黏液層204個差異OTU進行比對,得到2個相同差異OTU,分別屬毛螺菌科。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)補脾益腸丸、外黏液層差異OTUs及UC三者不存在直接作用關系,即補脾益腸丸對UC模型小鼠腸道外黏液層菌群具有一定的調節(jié)作用,但并未經(jīng)外黏液層菌群調節(jié)途徑發(fā)揮對UC治療作用。9.將補脾益腸丸組-模型組內黏液層35個差異OTU與空白組-模型組內黏液層110個差異OTU進行比對,得到5個相同差異OTU,分別屬毛螺菌科、毛螺菌科bacterium_6-1種、Allobaculum屬。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)補脾益腸丸、內黏液層差異OTUs及UC三者不存在直接作用關系,即補脾益腸丸對UC模型小鼠腸道內黏液層菌群具有一定的調節(jié)作用,但并未經(jīng)內黏液層菌群調節(jié)途徑發(fā)揮對UC治療作用。10.將嘎日迪散組外黏液層37個差異OTU與空白組-模型組外黏液層204個差異OTU進行比對,得到16個相同差異OTU,分別為海旋菌屬、毛螺菌科、Eubacterium_desmolans 種、Blautia 屬、乳酸菌屬、Turicibacter 屬、Gastranaerophilales目、羅斯氏菌屬、腸桿菌科、鏈球菌屬。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)嘎日迪、外黏液層差異OTUs及UC三者相互作用關系,即嘎日迪散可直接影響外黏液層毛螺菌科細菌來發(fā)揮對UC的治療作用。11.將嘎日迪散組內黏液層58個差異OTU與空白組-模型組內黏液層110個差異OTU進行比對,得到5個相同差異OTU,分別屬毛螺菌科、惡臭假單胞菌種、韋榮球菌科Incertae_Sedis屬、擬桿菌屬。將以上共同差異菌進行因果關系分析后發(fā)現(xiàn)嘎日迪散、內黏液層差異OTUs及UC三者不存在直接作用關系,即嘎日迪散對UC模型小鼠腸道內黏液層菌群具有一定的調節(jié)作用,但并未經(jīng)內黏液層菌群調節(jié)途徑發(fā)揮對UC治療作用。結論:本研究發(fā)現(xiàn)UC模型小鼠腸道內容物菌群出現(xiàn)失調現(xiàn)象,失調菌群之間存在一定的相關作用關系,其中與UC有直接作用的細菌為擬桿菌目S24-7 科(Bacteroidales family S24-7)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、An aerotruncus屬共3類細菌,與UC有間接作用的細菌有韋榮球菌科、Turici bacter科、擬桿菌屬等共141類細菌。擬桿菌目S24-7科細菌和瘤胃球菌科細菌與UC呈負相關,而Anaerotruncus屬細菌與UC呈正相關。當給予UC模型小鼠不同藥物時,腸道內容物菌群失調有不同程度的調整,也說明UC的發(fā)生與腸道菌群失調存在一定相關性。常用的UC治療藥物作用機制雖尚不明確,但其發(fā)揮作用的機制可能與調節(jié)腸道菌群失衡相關,并且這些藥物參與調整的菌群不同,本研究發(fā)現(xiàn)給予UC模型小鼠嘎日迪散后,嘎日迪散可通過直接影響毛螺菌科細菌來發(fā)揮對UC的治療作用,并且毛螺菌科細菌屬厚壁菌門(Firmicutes),由此推測嘎日迪散可通過調節(jié)腸道內厚壁菌門細菌來發(fā)揮治療UC作用,未來需進一步實驗驗證。在上述研究基礎上,本研究對腸道菌群與UC模型小鼠結腸各部位關系進行了探討,發(fā)現(xiàn)腸道內容物菌群變化相較于黏液層并不顯著,菌群結構和種類的變化主要集中于結腸外黏液層,關注腸道黏液層之間特別是外黏液層菌群變化特征對于探究炎癥性腸病菌群共性特點以及與疾病之間相互關系將具有更為重要的意義。基于該結論,本研究對嘎日迪散對腸道不同結構菌群的調節(jié)作用進行了分析,發(fā)現(xiàn)嘎日迪散可對腸道黏液層擬桿菌門(Bacter oidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)細菌產生調節(jié)作用,并通過對腸道外黏液層毛螺菌科細菌的調節(jié)發(fā)揮對UC的治療作用�；谝陨涎芯拷Y果,本研究認為腸道菌群研究僅限于內容物菌群變化并不能完整揭示腸道菌群變化規(guī)律,應結合黏液層菌群變化規(guī)律共同研究腸道菌群變化特點。嘎日迪散對腸道菌群具有較好的調節(jié)作用,但對結腸內容物和外、內黏液層菌群的調節(jié)作用并不相同,毛螺菌科細菌可能成為研究嘎日迪散治療UC機制的重要直接作用靶點。
【學位授予單位】：中央民族大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R29;R-332
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本文編號：2609894