【摘要】：研究目的探究炎癥因子TNF-α是否會影響小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向汗腺細(xì)胞分化以及從表觀遺傳學(xué)角度揭示其調(diào)控機(jī)制。研究內(nèi)容1.TNF-α對小鼠MSCs汗腺向特異分化的影響(1)MSCs來源廣、易獲取、免疫原性低和具有多向分化潛能,被認(rèn)為是以干細(xì)胞為中心的細(xì)胞治療的理想細(xì)胞來源。利用基因編輯技術(shù)、與汗腺細(xì)胞在基質(zhì)膠中共培養(yǎng)等方法可以成功的誘導(dǎo)MSCs在體外獲得汗腺細(xì)胞的表型,這使得未來深度燒傷患者的汗腺功能再生成為可能。為了解決MSCs體外誘導(dǎo)效率低、誘導(dǎo)周期長,同時為了避免基因編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)、傳遞系統(tǒng)的有效性和安全性、免疫排斥反應(yīng)、倫理爭論以及基質(zhì)膠力學(xué)性質(zhì)差、不穩(wěn)定、在體內(nèi)被吸收過快等問題,我們利用生物打印技術(shù)在體外構(gòu)建類細(xì)胞外基質(zhì)模擬汗腺發(fā)生發(fā)育的微環(huán)境誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞分化。(2)微環(huán)境可以影響MSCs的功能,研究證明TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)會抑制MSCs向骨、軟骨及脂肪細(xì)胞分化。結(jié)合燒傷患者的生理病理狀態(tài),為了有效的誘導(dǎo)MSCs在患者創(chuàng)面向汗腺分化,我們在體外模擬炎癥微環(huán)境并檢測TNF-α對MSCs向汗腺細(xì)胞分化的影響。2.TNF-α調(diào)控小鼠MSCs向汗腺細(xì)胞分化的表觀遺傳機(jī)制(1)多能性調(diào)控因子Nanog不僅與胚胎干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞分化潛能相關(guān),也參與調(diào)控MSCs分化過程,研究證明敲低MSCs的Nanog會抑制其增殖以及分化潛能。為了闡明TNF-α影響MSCs向汗腺細(xì)胞分化的機(jī)制,我們檢測了TNF-α對其Nanog表達(dá)的影響。(2)N6-甲基腺苷(m6A)是哺乳動物細(xì)胞中最常見的一種mRNA內(nèi)部甲基化修飾,由以甲基化酶METTL3為主的甲基化酶復(fù)合物METTL3/METTLL14/WATP和去甲基化酶FTO和ALKBH5共同調(diào)控以維持其動態(tài)平衡,參與維持機(jī)體多種生理功能和病理過程。Nanog已被證明含有m6A修飾,調(diào)控Nanog mRNA的m6A水平可以影響其mRNA豐度進(jìn)而決定胚胎干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞的命運(yùn)�；谶@些研究成果以及為了闡明TNF-α調(diào)控MSCs表達(dá)Nanog的機(jī)制,我們首先探究TNF-α對MSCs總RNA m6A水平的影響以及參與調(diào)控這種變化的甲基化酶或去甲基化酶。(3)研究發(fā)現(xiàn)甲氯滅酸(MA)是FTO的選擇性抑制劑,可與FTO競爭結(jié)合m6A修飾的核酸而提高細(xì)胞總RNA m6A水平。為了驗(yàn)證FTO的去甲基化作用參與調(diào)控TNF-α對MSCs Nanog表達(dá)及定向分化的影響,我們用MA的乙酯形式MA_2抑制MSCs FTO的去甲基化作用并觀察其對MSCs m6A水平、FTO表達(dá)、Nanog表達(dá)及向汗腺細(xì)胞分化的影響。(4)m6A修飾會加速mRNA降解而調(diào)控其表達(dá)水平。為了進(jìn)一步揭示TNF-α影響下FTO的去甲基化作用如何調(diào)控Nanog表達(dá),我們檢測了TNF-α對MSCs Nanog的m6A水平和其半衰期的影響。研究方法1.TNF-α對小鼠MSCs汗腺向特異分化的影響(1)在二維培養(yǎng)、二維培養(yǎng)結(jié)合小鼠足部勻漿、以仿生材料為主要成分的類細(xì)胞外基質(zhì)、以仿生材料和小鼠足部真皮勻漿為主要成分的類汗腺細(xì)胞外基質(zhì)四種條件下誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞分化,培養(yǎng)14天后用RT-qPCR方法和免疫熒光方法檢測各組細(xì)胞表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)記物的差異。(2)利用生物打印技術(shù)構(gòu)建以仿生材料和小鼠足部真皮勻漿為主要成分的類汗腺細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞分化,分別給與20ng/ml的TNF-α和空白處理,培養(yǎng)14天后,用RT-qPCR方法和免疫熒光方法檢測各組細(xì)胞表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)記物的差異。2.TNF-α調(diào)控小鼠MSCs向汗腺細(xì)胞分化的表觀遺傳機(jī)制(1)在2D培養(yǎng)條件下和3D培養(yǎng)條件下,分別給與MSCs 20ng/ml的TNF-α和空白處理,繼續(xù)培養(yǎng)6小時后,RT-qPCR方法和Western blot方法檢測TNF-α對MSCs表達(dá)Nanog的影響。(2)MSCs融合約80%時分別給與20ng/ml的TNF-α和空白處理,繼續(xù)培養(yǎng)6小時后,免疫熒光檢測兩組MSCs總RNA的m6A修飾水平的差異。再結(jié)合RT-qPCR方法和Western blot方法檢測兩組細(xì)胞中甲基化酶、去甲基化酶表達(dá)的差異。(3)用MA2抑制FTO去甲基化作用來驗(yàn)證是否FTO的去甲基化作用在TNF-α調(diào)控MSCs分化過程中發(fā)揮重要的作用。首先結(jié)合免疫熒光方法檢測MA2對MSCs總RNA m6A修飾水平的影響。其次利用RT-qPCR方法和Western blot方法檢測MA2是否引起FTO在mRNA和蛋白水平的表達(dá)發(fā)生變化。然后檢測了MA2對MSCs Nanog在mRNA和蛋白水平的表達(dá)的影響。最后結(jié)合RT-qPCR方法和免疫熒光方法驗(yàn)證MSCs在類汗腺細(xì)胞外基質(zhì)中誘導(dǎo)14天后汗腺細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)差異。(4)結(jié)合MeRIP-qPCR技術(shù)檢測TNF-α對MSCs Nanog mRNA的m6A修飾水平影響。其次利用放線菌素D抑制細(xì)胞RNA合成,結(jié)合RT-qPCR方法驗(yàn)證Nanog mRNA的m6A修飾水平對其半衰期的影響。研究結(jié)果1.TNF-α對小鼠MSCs汗腺向特異分化的影響(1)利用生物打印技術(shù)在體外構(gòu)建的以仿生材料、小鼠足部勻漿為主要成分的類汗腺細(xì)胞外基質(zhì)模擬汗腺發(fā)生發(fā)育的微環(huán)境可以誘導(dǎo)MSCs向汗腺細(xì)胞分化,在mRNA和蛋白水平表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)記物。(2)相對與對照組,TNF-α處理組MSCs在同樣條件下誘導(dǎo)14天后汗腺細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)明顯受到抑制。結(jié)果表明炎癥因子TNF-α不僅可以抑制MSCs向骨、軟骨、脂肪細(xì)胞分化,也會抑制其向汗腺細(xì)胞分化。2.TNF-α調(diào)控小鼠MSCs向汗腺細(xì)胞分化的表觀遺傳機(jī)制(1)與對照組相比,TNF-α處理組MSCs Nanog的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均被抑制,提示TNF-α通過調(diào)控Nanog表達(dá)影響MSCs分化,這與敲低MSCs的Nanog會抑制其增殖以及分化潛能的理論一致。(2)與對照組相比,MSCs接觸TNF-α6小時后總RNA的m6A修飾水平顯著提高,去甲基化酶FTO在mRNA和蛋白水平的表達(dá)受到抑制,但是兩組間甲基化酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5基因的表達(dá)沒有顯著差異。綜上所述,TNF-α抑制FTO表達(dá)導(dǎo)致MSCs總RNA的m6A修飾水平顯著提高。(3)與對照組相比,MSCs接觸MA2僅6小時后總RNA的m6A修飾水平顯著提高。但兩組之間FTO在mRNA和蛋白水平的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與MA2是通過與FTO競爭結(jié)合m6A修飾位點(diǎn)而抑制FTO去甲基化作用的理論一致。此外,MA2在mRNA和蛋白水平抑制Nanog的表達(dá),導(dǎo)致MSCs在類汗腺細(xì)胞外基質(zhì)中誘導(dǎo)14天后汗腺細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)明顯減少。由此可知,FTO的去甲基化作用在調(diào)控MSCs表達(dá)Nanog和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。(4)TNF-α抑制FTO表達(dá)提高了MSCs Nanog mRNA的m6A修飾水平導(dǎo)致Nanog mRNA的半衰期明顯縮短,這與m6A修飾會加速mRNA降解理論一致。研究結(jié)論TNF-α抑制MSCs表達(dá)去甲基化酶FTO,導(dǎo)致Nanog mRNA的m6A水平增加,使Nanog mRNA穩(wěn)定性下降而加速降解,最終表現(xiàn)為MSCs的分化潛能受到抑制。我們的發(fā)現(xiàn)首次闡明了m6A修飾在MSCs功能中的重要性,為微環(huán)境在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MSCs的多能性提供了新的認(rèn)識。此外,通過調(diào)節(jié)m6a修飾維持MSCs分化能力,為干細(xì)胞介導(dǎo)的再生醫(yī)學(xué)提供了一個新的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞在體外類汗腺細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境中可以向汗腺細(xì)胞分化。圖 A.RT-qPCR 方法檢測不同條件下間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)記物基因的差異。圖 B. 免疫熒光方法檢測不同條件下間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的差異。1.2.2 TNF-α 對小鼠 MSCs 向汗腺細(xì)胞分化的影響為了探究 TNF-α 對對間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化的影響，我們通過調(diào)控MSCs 細(xì)胞外基質(zhì)中 TNF-α 的濃度，和利用 RT-qPCR 方法和免疫熒光方法檢測各組汗腺細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的差異。實(shí)驗(yàn)分為 TNF-α 處理組和空白對照組，RT-qPCR 和免疫熒光結(jié)果分析，MSCs 在體外構(gòu)建的類細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境中誘導(dǎo) 14 天后，可以獲得汗腺細(xì)胞表型，在基因和蛋白水平表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)志物。TNF-α 處理組的 MSCs 在相同的條件下誘導(dǎo) 14 天后汗腺細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著低于對照組。

圖 1.2 炎癥介質(zhì) TNF-α 抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化。圖 A. TNF-α 處理 MSCs 示意圖。圖 B.RT-qPCR 方法檢測 TNF-α 對 MSCs 汗腺細(xì)胞標(biāo)記物基因表達(dá)的影響。圖 B. 免疫熒光方法檢測 TNF-α 對 MSCs 汗腺細(xì)胞標(biāo)記物蛋白表達(dá)的影響。1.3 討論1.3.1 小鼠 MSCs 在體外類汗腺細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境中可以向汗腺細(xì)胞分化在人體的皮膚上大約分布著 330 多萬個汗腺，這些汗腺通過排汗功能發(fā)揮重要的體溫調(diào)節(jié)作用，維持著機(jī)體正常的新陳代謝。然而，汗腺細(xì)胞再生能力很弱，汗腺被破壞后不能通過自我修復(fù)而恢復(fù)原有結(jié)構(gòu)功能。大面積深度燒傷的患者即使因醫(yī)療水平發(fā)展而幸存下來，因汗腺結(jié)構(gòu)破壞使排汗功能喪失也會嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，面臨著高汗癥、熱休克等危險。因此，，尋求合適的外源性細(xì)胞來替代損傷的汗腺細(xì)胞以及恢復(fù)汗腺的功能是急需解決的問題。MSCs 具有自我更新和多向分化的能力，在一定的條件誘導(dǎo)下，MSCs 不僅
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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本文編號：2608069