發(fā)布時間：2020-03-30 14:40

【摘要】：目的:證明EV71具有誘導神經細胞自噬及凋亡的作用;初步探討了EV71誘導神經細胞自噬的可能的分子機制。方法:在體外細胞實驗中,運用芯片技術檢測了人神經細胞SH-SY5Y感染EV71病毒后細胞內差異表達的miRNAs;在眾多差異表達的miRNAs中,通過qRT-PCR驗證了部分差異表達的基因,并初步確定了可能與自噬相關的mir-29b,運用生物信息學手段尋找到其可能的靶基因PLD1;同時運用qRT-PCR,western blot及激光共聚焦技術檢測了感染EV71病毒的SH-SY5Y細胞發(fā)生自噬的情況;隨后使用mir-29b mimics來調節(jié)細胞內mir-29b的表達水平后,再檢測細胞自噬水平的變化情況;運用western blot及流式細胞術檢測了病毒感染后細胞的凋亡情況。結果:qRT-PCR實驗結果顯示EV71可下調SH-SY5Y細胞mir-29b的表達水平,自噬相關的基因beclin-1表達水平明顯上調,p62表達量則顯著下降;western blot結果顯示EV71感染細胞后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加;此外,隨著感染時間推移,細胞內GFP-LC3熒光集聚顯著增加。通過轉染miRNA mimics上調細胞內mir-29b的表達后,檢測EV71感染神經細胞后自噬相關基因表達的變化情況,其中Beclin-1表達量有所下調,p62表達量則明顯上升,PLD1表達量出現(xiàn)明顯上升;western blot中的自噬指標LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值則有明顯減小。western blot結果顯示,隨EV71感染細胞的時間推移Bcl-2的表達量逐漸下降;與此同時,流式細胞術檢測結果表明隨EV71感染時間的延長,發(fā)生凋亡的細胞數(shù)量顯著增加。結論:上述實驗結果提示,EV71可誘導SH-SY5Y細胞出現(xiàn)自噬及凋亡,下調細胞內的mir-29b表達;當上調細胞內mir-29b的表達水平時,EV71誘導SH-SY5Y自噬的作用可被逆轉。說明EV71誘導人神經源性細胞SH-SY5Y發(fā)生自噬的作用是通過mir-29b途徑實現(xiàn)的。
【圖文】：

圖 1.1 EV71 感染后細胞內 LC3 蛋白集聚情況實驗用表達 mCherry-GFP-LC3B 融合蛋白的腺病毒來感染體外培養(yǎng)的 SH-SY5Y 細胞。毒感染 24h 后，在培養(yǎng)體系中加入 EV71，選取 EV71 感染 0h，6h，12h，24h 這四個來觀察細胞內 GFP-LC3 陽性斑點集聚情況。由圖可見，，隨著 EV71 感染時間的推移，

圖 1.2 EV71 感染后細胞內相關基因表達變化情況的 SH-SY5Y 細胞在感染 EV71 后 12h 提取細胞 RNA 進行 qRT-PC照組相比較，在 EV71 病毒處理組中，病毒結構基因 VP1 的表達量 Beclin-1 表達增強，p62 的表達水平則有明顯的下降。**表示 P＜0
【學位授予單位】：武漢科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R373.2

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