【摘要】：目的:證明EV71具有誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬及凋亡的作用;初步探討了EV71誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的可能的分子機(jī)制。方法:在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,運(yùn)用芯片技術(shù)檢測(cè)了人神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y感染EV71病毒后細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的miRNAs;在眾多差異表達(dá)的miRNAs中,通過qRT-PCR驗(yàn)證了部分差異表達(dá)的基因,并初步確定了可能與自噬相關(guān)的mir-29b,運(yùn)用生物信息學(xué)手段尋找到其可能的靶基因PLD1;同時(shí)運(yùn)用qRT-PCR,western blot及激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)了感染EV71病毒的SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生自噬的情況;隨后使用mir-29b mimics來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)mir-29b的表達(dá)水平后,再檢測(cè)細(xì)胞自噬水平的變化情況;運(yùn)用western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了病毒感染后細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EV71可下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞mir-29b的表達(dá)水平,自噬相關(guān)的基因beclin-1表達(dá)水平明顯上調(diào),p62表達(dá)量則顯著下降;western blot結(jié)果顯示EV71感染細(xì)胞后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加;此外,隨著感染時(shí)間推移,細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3熒光集聚顯著增加。通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics上調(diào)細(xì)胞內(nèi)mir-29b的表達(dá)后,檢測(cè)EV71感染神經(jīng)細(xì)胞后自噬相關(guān)基因表達(dá)的變化情況,其中Beclin-1表達(dá)量有所下調(diào),p62表達(dá)量則明顯上升,PLD1表達(dá)量出現(xiàn)明顯上升;western blot中的自噬指標(biāo)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值則有明顯減小。western blot結(jié)果顯示,隨EV71感染細(xì)胞的時(shí)間推移Bcl-2的表達(dá)量逐漸下降;與此同時(shí),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明隨EV71感染時(shí)間的延長,發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。結(jié)論:上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,EV71可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞出現(xiàn)自噬及凋亡,下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的mir-29b表達(dá);當(dāng)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)mir-29b的表達(dá)水平時(shí),EV71誘導(dǎo)SH-SY5Y自噬的作用可被逆轉(zhuǎn)。說明EV71誘導(dǎo)人神經(jīng)源性細(xì)胞SH-SY5Y發(fā)生自噬的作用是通過mir-29b途徑實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

圖 1.1 EV71 感染后細(xì)胞內(nèi) LC3 蛋白集聚情況實(shí)驗(yàn)用表達(dá) mCherry-GFP-LC3B 融合蛋白的腺病毒來感染體外培養(yǎng)的 SH-SY5Y 細(xì)胞。毒感染 24h 后，在培養(yǎng)體系中加入 EV71，選取 EV71 感染 0h，6h，12h，24h 這四個(gè)來觀察細(xì)胞內(nèi) GFP-LC3 陽性斑點(diǎn)集聚情況。由圖可見，，隨著 EV71 感染時(shí)間的推移，

圖 1.2 EV71 感染后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)變化情況的 SH-SY5Y 細(xì)胞在感染 EV71 后 12h 提取細(xì)胞 RNA 進(jìn)行 qRT-PC照組相比較，在 EV71 病毒處理組中，病毒結(jié)構(gòu)基因 VP1 的表達(dá)量 Beclin-1 表達(dá)增強(qiáng)，p62 的表達(dá)水平則有明顯的下降。**表示 P＜0
【學(xué)位授予單位】：武漢科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R373.2

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本文編號(hào)：2607677