【摘要】：研究背景人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是皰疹病毒家族的重要組成成員之一,可導(dǎo)致先天性腦組織發(fā)育障礙及免疫缺陷人群的腦功能損害。先天性HCMV感染可導(dǎo)致智力低下,視神經(jīng)萎縮,癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在免疫功能低下人群中,HCMV感染可引起HCMV相關(guān)性腦炎或腦病,造成極高的致殘或致死率。腦組織是HCMV感染的主要靶器官之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中HCMV優(yōu)先感染神經(jīng)元細胞,然而關(guān)于其在神經(jīng)細胞中復(fù)制過程的機制研究甚少。因此,了解HCMV在神經(jīng)細胞中的復(fù)制機制或?qū)︻A(yù)防HCMV所致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。MicroRNAs(MiRNAs)是一類非編碼的小分子RNA,其長度通常約為21-25個核苷酸,可參與調(diào)控多種病毒的感染過程。在登革熱病毒感染宿主細胞時,miR-146可通過靶向TRAF6來抑制干擾素的表達,以促進登革熱病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制。流感病毒可導(dǎo)致miR-146a和miR-155的異常表達,從而抑制宿主細胞內(nèi)Ⅰ型干擾素(IFN)應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-138可參與調(diào)控HCMV在內(nèi)皮細胞的復(fù)制過程,然而關(guān)于miRNAs對HCMV感染神經(jīng)細胞的調(diào)控研究相對較少,這引起了我們極大的研究興趣。免疫調(diào)節(jié)在HCMV感染宿主細胞過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在免疫功能正常人群中,免疫系統(tǒng)可抑制HCMV在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制。而在免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟或免疫功能缺陷人群中,免疫系統(tǒng)并不能有效抑制HCMV的感染過程。此外,HCMV還可誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫逃逸機制,在宿主體內(nèi)長期隱匿存在,當機體免疫力下降時,病毒可在宿主細胞內(nèi)大量復(fù)制。由此表明免疫系統(tǒng)參與調(diào)控HCMV在宿主細胞內(nèi)復(fù)制過程。因此,我們推測miRNAs或可通過調(diào)控機體免疫應(yīng)答反應(yīng)激活HCMV在神經(jīng)細胞內(nèi)復(fù)制過程。研究目的1篩選HCMV感染宿主在神經(jīng)細胞前后差異表達顯著的microRNAs;2研究miR-182在神經(jīng)細胞上對HCMV復(fù)制的影響;3鑒定miR-182作用的靶基因;4分析miR-182在神經(jīng)細胞上調(diào)控HCMV復(fù)制的分子機制。研究內(nèi)容1 microRNA芯片篩選以及miR-182的水平檢測;2 miR-182對干擾素免疫應(yīng)答及HCMV復(fù)制的調(diào)控;3 miR-182的靶基因預(yù)測鑒定及其對miR-182調(diào)控干擾素免疫應(yīng)答及HCMV復(fù)制的干預(yù)作用;4動物模型中miR-182 agomir對HCMV病毒復(fù)制的影響。研究方法1通過分析HCMV感染宿主細胞前后microRNA芯片數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)來源GEO數(shù)據(jù)庫,Accession:GSE33584和GSE75305),挑選上調(diào),下調(diào)最明顯的8條microRNA驗證;2 U-251MG,NPCs兩株神經(jīng)細胞在不同感染時間,不同感染濃度對miR-182水平的影響;3在U-251MG,NPCs兩株神經(jīng)細胞中過表達或者干擾miR-182后,檢測HCMV拷貝數(shù),病毒滴度以及病毒的兩個關(guān)鍵蛋白(IE2與pp65)的表達;4在U-251MG,NPCs兩株神經(jīng)細胞中過表達或者干擾miR-182后,檢測內(nèi)源性IFN-α/β的生成;5將si-IFN-αreceptor I(IFNAR1)和si-IFNAR2轉(zhuǎn)染U-251 MG和NPCs細胞,使IFNAR1與IFNAR2沉默,檢測干擾素刺激因子(ISGs)、MxA與OAS1的表達,同時檢測HCMV拷貝數(shù)與病毒滴度;6采用兩種在線軟件TargetScan 7.0(targetscan.org/)與miRanda(microrna.org/)預(yù)測miR-182的靶基因,并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸赡茏饔玫陌谢?the fork head box O3,FOXO3)進行驗證。在HCMV感染前轉(zhuǎn)染miR-182模擬物到U-251 MG和NPCs中,檢測FOXO3及其下游基因IRF7的蛋白表達變化;7靶基因功能研究,通過構(gòu)建pcDNA-FOXO3過表達質(zhì)粒,將質(zhì)粒與miR-182模擬物共同轉(zhuǎn)染細胞進行過表達,檢測FOXO3過表達對對miR-182調(diào)控干擾素免疫應(yīng)答及HCMV復(fù)制的干預(yù)作用;8通過尾靜脈將agomiR-182注射到5只小鼠中,使其在小鼠體內(nèi)過表達,檢測miR-182過表達對HCMV在小鼠體內(nèi)復(fù)制的影響。研究結(jié)果1 HCMV感染細胞會導(dǎo)致宿主細胞microRNA表達譜的差異,其中miR-182上調(diào)變化最為顯著。且該效應(yīng)呈時間劑量依賴。2在U-251MG,NPCs兩株神經(jīng)細胞中,過表達miR-182能夠抑制病毒復(fù)制,而沉默miR-182的表達上調(diào)HCMV滴度。3在U-251MG,NPCs兩株神經(jīng)細胞中過表達miR-182促進I型干擾素免疫應(yīng)答,而沉默miR-182的表達抑制I型干擾素免疫應(yīng)答。同時我們發(fā)現(xiàn)HCMV感染能夠引起ISGs、MxA與OAS1表達上調(diào),而干擾IFNAR1與IFNAR2可以解除這種上調(diào)的作用,更重要的是還可以解除miR-182模擬物對病毒復(fù)制的抑制作用。4通過兩種不同軟件,我們發(fā)現(xiàn)miR-182的靶基因可能為FOXO3。通過雙熒光素酶報告基因試驗證實FOXO3為miR-182的靶基因。另一方面,我們還發(fā)現(xiàn)在病毒感染情況下,miR-182過表達能夠抑制FOXO3的表達,增強IRF7的轉(zhuǎn)錄活性。5 miR-182過表達促進干擾素免疫應(yīng)答,抑制HCMV的復(fù)制。但是同時轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXO3以后,miR-182的抗病毒功能被抑制。正相反,同時轉(zhuǎn)染si-IRF7后,miR-182的抗病毒功能得到增強。6在動物模型中miR-182過表達同樣能夠抑制HCMV的復(fù)制,且FOXO3和IRF7水平對應(yīng)調(diào)控。研究結(jié)論1 HCMV感染神經(jīng)細胞顯著上調(diào)miR-182的表達。2神經(jīng)細胞中miR-182過表達通過上調(diào)IFN-α/β的表達,激活下游ISGs、MxA與OAS1的表達,進而抑制HCMV的復(fù)制。3神經(jīng)細胞中miR-182通過靶向抑制FOXO3,上調(diào)IRF7從而激活干擾素免疫應(yīng)答,發(fā)揮抗病毒作用。4動物模型中miR-182過表達同樣能夠抑制HCMV的復(fù)制。
【圖文】：

第一章 引言因組結(jié)構(gòu)特征因組是所有皰疹病毒中最大的，GC 含量較高。與單純皰疹的獨特序列(Unique Long, UL)和短的獨特序列(Unique Sh的兩端都帶有反向重復(fù)序列(TRL, IRL, IRS 和 TRS)（圖 1-1毒的基因組可以呈現(xiàn) 4 種形式的同分異構(gòu)體。相反，，動物 C病毒的基因組是線性的，沒有重復(fù)區(qū)域。UL 和 US 區(qū)域的反的直接重復(fù)序列(a，b，c)和 UL-US 連接處的反向重復(fù)序列(a

第一章 引言3-1;miR-m22-1;miR-M23-2;miR-M44-1;miR-M55-1;miRm59-m59-2;miR-M87-1;miR-m88-1;miR-M95-1;miR-m107-1;miR-1; miRm108-2V 24 miR-r1-1;miR-r1-2;miR-r1-3;miR-r1-4;miR-r6-1;miR-R37-1;m3.1-1;miRr43.1-2;miR-OriLyt-1;miR-OriLyt-2;miRR87-1;miR;miR-R91-1;miR-r95.1-1;miR-r111.1-1;miR-r111.1-2;miR-r11miR-r111.2-1;miR-r111.2-2;miR-r111.2-3;miR-r111.2-4;miR-5;miR-r111.2-6; miR-r170-1
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2606477