【摘要】：目的細胞分裂周期蛋白14A(cell division cycle 14A,Cdc14A)磷酸酶作為高度保守的絲/蘇氨酸雙特異性磷酸酶家族中的一員,最初是由L.Hartwell在篩查調(diào)控出芽酵母細胞周期基因時意外發(fā)現(xiàn)并命名~([1])。它在真核生物(從單細胞真菌中的酵母菌到人類)G2期阻滯中發(fā)揮著穩(wěn)定的保守性作用~([2])。Cdc14在G2/M轉換時能下調(diào)Cdk1的活性,其功能涉及有絲分裂后期的調(diào)控及退出有絲分裂和胞質(zhì)分裂~([1])。對酵母菌及人類骨肉瘤細胞的研究表明,Cdc14作為重要的細胞周期進程調(diào)控因子,其表達的缺失不僅會抑制DNA合成,還會阻礙細胞分裂。Cdc14在哺乳動物細胞中表達兩種亞型,分別為hCdc14A和hCdc14B~([3])。hCdc14A在間期定位于中心體,具有調(diào)節(jié)中心體復制的功能,該功能的實現(xiàn)依賴于它與中心體的相互作用~([4,5])。hCdc14B在間期定位在細胞核仁,還有部分定位在中心體和紡錘體,hCdc14B通過直接與微管結合達到保持主軸穩(wěn)定的作用。綜上,hCdc14A與hCdc14B在定位及功能方面存在差異~([6])。此外,hCdc14A在細胞內(nèi)的表達水平也會對細胞分裂產(chǎn)生影響。過表達時會引起DNA合成期中心體的提前分離、畸形及多極紡錘體的形成;相反,當表達水平下降時可能會導致胞質(zhì)不分裂~([1])。Cdc14A磷酸酶在小鼠卵母細胞生發(fā)泡期定位于細胞核仁,在生發(fā)泡破裂后集聚在染色體周圍,而在第一次減數(shù)分裂的前期(MⅠ)和第二次減數(shù)分裂的中期(MⅡ)分散于整個細胞質(zhì)~([1])。小鼠受精卵是目前與人類較為接近的細胞周期研究模型,對其深入研究將有利于揭示哺乳動物的生殖、發(fā)育調(diào)控機制。本研究通過應用Real-time PCR技術和Western印跡法確定小鼠一細胞期受精卵四個時相是否存在Cdc14A蛋白,Cdc14A蛋白的mRNA相對表達量在G2/M轉換前后有無變化及應用免疫熒光確定Cdc14A蛋白在小鼠一細胞期受精卵細胞內(nèi)的定位,為今后研究Cdc14A蛋白調(diào)控小鼠一細胞期受精卵G2/M轉換中的作用奠定了堅實的基礎。方法1.小鼠腹腔內(nèi)注射PMSG、HCG使其超排卵并采集G1、S、G2、M四個時相的小鼠受精卵細胞;2.運用Real-time PCR技術檢測小鼠一細胞期受精卵G1、S、G2、M四個時相的Cdc14A mRNA的相對表達量;3.運用Western印跡法檢測G1、S、G2、M四個時相Cdc14A蛋白的表達;4.運用間接免疫熒光觀察Cdc14A在小鼠一細胞期受精卵中的定位及核酸染色情況。結果1.Real-time PCR顯示Cdc14A蛋白在小鼠一細胞期受精卵G、S、G2、M期均有表達,在G1、S期Cdc14A mRNA的相對表達量較低,G2期的表達較G1、S期為高,到M期表達呈降低趨勢。2.Western印跡法檢測Cdc14A蛋白在小鼠一細胞期受精卵G1、S、G2、M期均有表達,G1、S期的表達較低,G2期的表達增高,M期表達有降低趨勢。3.間接免疫熒光觀察Cdc14A蛋白在小鼠一細胞期受精卵中的定位,Cdc14A蛋白(紅色熒光)在G1、S和G2期定位于細胞核仁,在M期Cdc14A(紅色熒光)均勻的分布于細胞質(zhì)。結論1.Cdc14A蛋白在小鼠一細胞期受精卵G1、S、G2、M期均有表達,G1、S期表達量較低,在G2期表達最高,到M期表達呈降低趨勢。2.Cdc14A在小鼠一細胞期受精卵G1、S和G2期定位于核仁,在M期Cdc14A從細胞核中釋放并擴散到整個細胞質(zhì)。
【圖文】：

表 1-1 小鼠一細胞期受精卵四個時相 Cdc14A mRNA 相對表達量G1 S G2 MCdc14A 1.00±0.01 0.87±0.08a3.56±0.01bc1.68±0.08bcda:與 G1 組比較無差異顯著（P>0.01）; b:與 G1 組比較差異顯著（P<0.01）; c:與 S 組比較差異顯著（P<0.01）; d:與 G2 組比較差異顯著（P<0.01）。

圖 2 Cdc14A mRNA 的融解曲線圖 3 Cdc14A mRNA 的相對表達量柱形圖2．小鼠受精卵在第一次有絲分裂進程各期的 Cdc14A 蛋白表達
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R321.2

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本文編號：2603803