【摘要】：目的:外泌體(exosomes)的直徑多介于30-150nm,凈化非常困難,目前已知的提取方法有多種,其中超速離心法以及溶劑沉淀法被廣泛應(yīng)用。本次實驗為了更高效的從脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)中提取exosomes,分別采用ExoQuick試劑盒法、超速離心法、ExoQuick試劑盒改良法進(jìn)行操作。Exosomes擁有的生物學(xué)活性物質(zhì)與其來源細(xì)胞類似,可在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞,發(fā)揮各種生物學(xué)功能。取成骨分化誘導(dǎo)方向的ADSCs,加入exosomes,經(jīng)透射電鏡、Western Blot檢測,判斷加入的exosomes是否增強(qiáng)ADSCs的成骨效能,并對這三種提取方法進(jìn)行比較。研究方法:提取并培養(yǎng)ADSCs,傳代至帶三代,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。對第三代ADSCs進(jìn)行成脂、成軟骨誘導(dǎo),分別于14天進(jìn)行油紅O染色以及28天進(jìn)行Alican染色,鏡下觀察誘導(dǎo)結(jié)果。對第三代ADSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,檢測CD10、CD31、CD34表達(dá)。使用ExoQuick試劑盒法、超速離心法、ExoQuick試劑盒改良法提取第三代ADSCs來源exosomes,使用透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。Western Blot法對exosomes進(jìn)行檢測,觀察CD9、CD63蛋白表達(dá)情況;分別將3種方法提取的exosomes加入成骨誘導(dǎo)液中,并設(shè)置一組不加exosomes的成骨誘導(dǎo)液作為空白對照,將以上4組分別用于ADSCs成骨分化誘導(dǎo)過程中,通過對照實驗檢測4組ADSCs形態(tài)學(xué)變化及Runx2、OCN蛋白表達(dá)。結(jié)果:1、電鏡下可見第三代ADSCs細(xì)胞形態(tài)均一,呈明顯方向性。2、ADSCs成脂誘導(dǎo)后,經(jīng)油紅O染色鏡下觀察,胞漿內(nèi)脂滴被染成紅色;ADSCs成軟骨誘導(dǎo)后經(jīng)Alican染色鏡下觀察,胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)染色藍(lán)色。3、ADSCs經(jīng)過流式檢測,CD10表達(dá)陽性、*CD31表達(dá)陰性、*CD34表達(dá)陰性,符合ADSCs表型,表明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為ADSCs。4、3種提取方法獲得的樣本均可見到圓形、類圓形的膜性囊泡樣結(jié)構(gòu),特異性表面標(biāo)志物CD9、CD63均可表達(dá),且ExoQuick試劑盒改良法蛋白表達(dá)量最多;5、與未加exosomes的過程相比加入exosomes的ADSCs成骨誘導(dǎo)過程Runx2、OCN蛋白表達(dá)明顯增多,且ExoQuick試劑盒改良法蛋白表達(dá)量最多。結(jié)論:ExoQuick試劑盒改良法為提取ADSCs-Exos的最優(yōu)方法;提取的exosomes具備進(jìn)入ADSCs的活性,促進(jìn)ADSCs的成骨分化,且ExoQuick試劑盒改良法提取的exosomes誘導(dǎo)效果最好。
【圖文】：

ADSCs形態(tài)學(xué)觀察（倒置顯微鏡x50）

圖 2 ADSCs鑒定結(jié)果（倒置顯微鏡 x100）A為ADSCs成脂化誘導(dǎo)油紅O染色結(jié)果。B為ADSCs成軟骨化誘導(dǎo)Alican染色結(jié)果。C為SCs流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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本文編號：2597292