發(fā)布時(shí)間：2020-03-23 19:51

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tubercuLosis,Mtb)是引起人和動物結(jié)核病的病原體。巨噬細(xì)胞作為Mtb的主要靶細(xì)胞和免疫細(xì)胞,在抗Mtb感染中發(fā)揮著重要作用。研究表明,巨噬細(xì)胞可通過自噬途徑有效清除Mtb,而Mtb也可通過某些機(jī)制逃避自噬的清除作用。酯酰輔酶 A 膽固醇�；D(zhuǎn)移酶(Acyl Coenzyme ACholesterol Acyltransferases,ACAT)蛋白家族在體內(nèi)膽固醇吸收與代謝平衡中發(fā)揮著重要作用。ACAT1是游離膽固醇酯化的關(guān)鍵酶,廣泛存在于動物組織和細(xì)胞中。ACAT1的高表達(dá)可影響胞內(nèi)膽固醇代謝平衡并促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化,也可對細(xì)胞自噬水平產(chǎn)生影響。為了探究ACAT1對Mtb誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的調(diào)控作用及其機(jī)制,本研究在BCG感染巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上,分別采用ACAT1抑制劑阿伐麥布(Avasimibe)、mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)處理 RAW264.7 細(xì)胞、牛肺泡巨噬細(xì)胞(Bovine alveolar macrophages,BAMs)及在RAW264.7細(xì)胞中過表達(dá)/干擾ACAT1后,檢測ACAT1蛋白、自噬相關(guān)蛋白、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及胞內(nèi)膽固醇水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.BCG感染BAM和RAW264.7細(xì)胞2h、6h、12h、24h后,隨感染時(shí)間的延長,ACAT1蛋白表達(dá)量、胞內(nèi)膽固醇酯含量和胞內(nèi)脂滴先下降后上升,RAW264.7細(xì)胞中12h最低,而BAMs中6h最低,而胞內(nèi)游離膽固醇含量與之相反。隨BCG感染時(shí)間的延長,自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LCⅡ/Ⅰ的表達(dá)量先上升后下降,RAW264.7細(xì)胞中12h最高,而BAMs中6h最高。結(jié)果提示,BCG感染巨噬細(xì)胞后,ACAT1可通過改變胞內(nèi)膽固醇水平影響細(xì)胞自噬水平。2.采用慢病毒轉(zhuǎn)染,并經(jīng)RT-PCR及Western blot方法驗(yàn)證,成功獲得了 ACAT1過表達(dá)/干擾的RAW264.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,為后續(xù)探究ACAT1在BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬中的調(diào)控作用提供了實(shí)驗(yàn)材料。3.用Avasimibe處理RAW264.7細(xì)胞和BAMs,并經(jīng)BCG感染12h后,自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5、Atg7和LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量顯著升高。結(jié)果表明,抑制ACAT1可促進(jìn)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬。4.BCG感染ACAT1過表達(dá)的RAW264.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株12h后,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7的表達(dá)量顯著降低,同時(shí)胞內(nèi)游離膽固醇含量亦顯著降低,膽固醇酯含量顯著升高;BCG感染ACAT1干擾的RAW264.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株12h后,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7表達(dá)量顯著升高,同時(shí)胞內(nèi)游離膽固醇含量亦顯著升高,膽固醇酯含量顯著降低。結(jié)果證實(shí),BCG感染巨噬細(xì)胞后,ACAT1可通過降低胞內(nèi)膽固醇酯含量從而促進(jìn)細(xì)胞自噬。5.采用Rapamycin處理RAW264.7細(xì)胞和BAMs,并經(jīng)BCG感染12h后,ACAT1蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明,PI3K/mTOR信號通路通過影響ACAT1表達(dá)進(jìn)而調(diào)控BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬水平。6.干擾或抑制ACAT1,并經(jīng)BCG感染巨噬細(xì)胞12h后,PI3K/mTOR信號通路相關(guān)蛋白PI3K、mTOR、P-mTOR和P-Akt蛋白的表達(dá)顯著下調(diào);而過表達(dá)ACAT1并經(jīng)BCG感染巨噬細(xì)胞12h后,PI3K/mTOR信號通路相關(guān)蛋白PI3K、mTOR和P-mTOR蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)果表明,BCG感染巨噬細(xì)胞后,ACAT1對PI3K/mTOR信號通路介導(dǎo)的自噬具有調(diào)控作用。上述結(jié)果顯示,在BCG感染巨噬細(xì)胞后,ACAT1通過影響胞內(nèi)膽固醇水平,并與PI3K/Akt/mTOR信號通路協(xié)同作用發(fā)揮對巨噬細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。
【圖文】：

邐第一章文獻(xiàn)綜述逡逑直接包裹部分胞質(zhì)進(jìn)入溶酶體［２７］。分子伴侶介導(dǎo)的自噬則是由特定蛋白介導(dǎo)的選擇性功能逡逑自噬，該過程由靶向基序ＫＦＥＲＱ所控制ｐ８］（圖１－１）。逡逑Ｃ－邋ＫＫＥＲＱ邋Ｍｏｌｉｆ邋Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ逡逑／邐Ｌｙ，邋°邋Ｃ邋＼ｊ邐Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邐，邐＼逡逑／邐丨１邐ａｕｔｏｐｈａｇｙ邐＼逡逑圖１－１細(xì)胞自噬的分類［２９］逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ逡逑巨自噬發(fā)生過程非常復(fù)雜，包括三個(gè)階段：自噬啟動階段、自噬體裝配和形成階段、逡逑自噬溶酶體形成及自噬溶酶體降解階段（圖１－２）。自噬的起始：在酵母細(xì)胞中，特異性自逡逑嗤體前體結(jié)構(gòu)〔ＰＡＳ）招募其他自嗤相關(guān)基因（ａｕｔｏｐｈａｇｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅ，Ａｔｇ）蛋白及囊泡逡逑等膜成分，形成雙層膜結(jié)構(gòu)，因此ＰＡＳ的形成是自噬發(fā)生的必要條件之一逡逑自噬的發(fā)生調(diào)節(jié)，受許多因素調(diào)控［３２］。自噬的起始途徑主要包括ＵＬＫ１復(fù)合物、磷脂酰逡逑肌醇３－激酶復(fù)合物和Ａｔｇ９循環(huán)機(jī)制的激活當(dāng)細(xì)胞營養(yǎng)充足時(shí)

ＡＣＡＴ主要以ＦＣ和長鏈脂肪酸�；o酶Ａ作為脂肪�；w，將ＦＣ酯化為ＣＥ。胞膜上ＦＣ的過度積累導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性。因此．ＡＣＡＴ酯化作用在防止細(xì)胞脂毒性過中至關(guān)重要［８１］。逡逑在哺乳類動物中．ＡＣＡＴ基因有兩種亞型，分別是ＡＣＡＴ１基因和ＡＣＡＴ２基因，編兩種不同的酯化酶。其中ＡＣＡＴ１在哺乳動物機(jī)體組織細(xì)胞中都有分布（如：肝臟、皮膚腸上皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），將ＦＣ酯化成ＣＥ以脂滴的形式儲存。ＡＣＡＴ２主要特異性分布于小腸和肝臟中，將ＦＣ酯化為ＣＥ．并以乳糜微粒和低密度脂蛋白兩種式包裝ＣＥ邋［８２Ｌ逡逑ＡＣＡＴ在全身膽固醇代謝平衡中起到重要的調(diào)節(jié)作用。小腸絨毛上皮細(xì)胞攝�。疲�，量的ＦＣ被ＡＣＡＴ２酶酯化為ＣＥ．最后以乳糜微粒形式參與全身循環(huán)。然而，進(jìn)入肝臟中ＣＥ通過膽固醇酯水解酶（ＣＥＨ）水解為ＦＣ，再次被ＡＣＡＴ２酯化為ＣＥ［８３］。在巨噬細(xì)胞中，逡逑ＡＣＡＴ１將ＦＣ酯化成ＣＥ，儲存在細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)膽固醇／膽固醇酯比率，另一部分通ＣＥＨ水解為ＦＣ外流出細(xì)胞．從而組裝成高密度脂蛋白（ＨＤＬ），最終以ＨＤＬ形式參與膽醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制［８４］。由于存在血腦屏障作用，導(dǎo)致外周膽固醇不能直接進(jìn)入到腦部，，而由膠質(zhì)細(xì)胞直接在腦部合成膽固醇進(jìn)行生理活動的需要＝邋ＡＣＡＴ１將一部分過量的ＦＣ酯化，逡逑另一部分被膽固醇２４－羥化酶合成２４－羥基膽固醇直接通過血腦屏障進(jìn)入腦部，最終被低度脂蛋白（ＬＤＬ）運(yùn)回肝臟，再次代謝［８５］（圖１－３）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q255;R392

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本文編號：2597187