發(fā)布時(shí)間：2020-03-20 04:38

【摘要】：瘧疾是由瘧原蟲感染引起的一種寄生原蟲病。這種古老的寄生蟲病至今仍然在全球104個(gè)國家肆虐流行,約33億人口受到威脅。盡管人們?yōu)橄懠沧鞒隽司薮笈?但該疾病依然給瘧疾流行區(qū)(特別是非洲地區(qū))人們的生命健康造成巨大威脅。由于目前尚無有效的商品化疫苗用于瘧疾預(yù)防,因此治療瘧疾的主要手段仍然是抗瘧藥物。但隨著這些藥物的廣泛應(yīng)用,很多流行區(qū)不可避免地出現(xiàn)了瘧原蟲抗藥性問題,尤其是在東南亞地區(qū),惡性瘧疾曾出現(xiàn)各類抗瘧藥物的抗性蟲株并迅速在世界范圍內(nèi)蔓延,使得瘧疾患病率和死亡率大大增加,這對(duì)全球的瘧疾防治和消除形成巨大威脅。世界衛(wèi)生組織于2005年推薦青蒿素聯(lián)合用藥(Artemisinin-based combination therapy,ACTs)作為一線療法在全球范圍內(nèi)推廣應(yīng)用。該藥物具有起效快、毒副作用小等特點(diǎn),在瘧疾流行地區(qū)有效地遏制了瘧疾傳播。然則2006-2007年,湄公河流域出現(xiàn)了以感染患者體內(nèi)蟲體清除時(shí)間延長為特征的青蒿素抗性蟲株并迅速擴(kuò)散,抗性蟲株的出現(xiàn)引起了科學(xué)家的擔(dān)憂,瘧疾的消除計(jì)劃再次面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。當(dāng)前亟待解決的難題是惡性瘧原蟲究竟是通過何種分子機(jī)制來產(chǎn)生青蒿素抗性。Ariey等人的前瞻性研究表明:惡性瘧原蟲13號(hào)染色體上的Pfkelch13(K13)基因上某些氨基酸位點(diǎn)的突變與青蒿素抗性之間存在緊密聯(lián)系。后續(xù)Mbengue等人發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)能夠抑制惡性瘧原蟲磷脂酰肌醇激酶(PfPI3K)的活性使其催化生成的磷脂酰肌醇(PI3P)減少,信號(hào)通路激活不完全,對(duì)蟲體產(chǎn)生致命損傷;同時(shí)K13的基因突變導(dǎo)致與PfPI3K的結(jié)合減少,PfPI3K泛素化降解減少使其在蟲體中積聚,導(dǎo)致其催化生成的PI3P量顯著升高,蟲株的抗性增強(qiáng)。這些研究提示PfK13-PfPI3K相互作用在青蒿素抗性機(jī)制中發(fā)揮作用,但具體的信號(hào)通路和分子機(jī)制仍不清楚。本課題旨在進(jìn)一步探索惡性瘧原蟲青蒿素抗性產(chǎn)生的分子機(jī)制,分析PfPI3K通路在青蒿素抗性產(chǎn)生過程中的具體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期通過三年的藥物壓力篩選成功培育出六對(duì)青蒿素抗性蟲株,并選擇其中兩對(duì)蟲株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜測(cè)序分析,通過分析共同差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)了編碼惡性瘧原蟲脂酰輔酶A合成酶-1a(PF3D7_1479000,PfACS1a)的基因在青蒿素抗性蟲株中低表達(dá),提示該基因與青蒿素抗性相關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上,通過對(duì)該基因進(jìn)行功能抑制和過表達(dá)來探索其對(duì)蟲體青蒿素敏感性的影響,隨后對(duì)其所在的通路和相關(guān)的分子作用機(jī)制進(jìn)行深入探索,最終旨在闡明PfACS1a在惡性瘧原蟲青蒿素抗性產(chǎn)生過程中的具體功能。本研究取得的結(jié)果如下:1、青蒿素抗性蟲株P(guān)fACS1a基因的表達(dá)下調(diào)本研究中所用到的6對(duì)青蒿素抗性蟲株為本實(shí)驗(yàn)室前期采用持續(xù)性提高藥物濃度的方法體外培育獲得的抗性蟲株。6對(duì)蟲株分別為F0827/F0827ART、F0867/F0867ART、F09P-1/F09P-1ART、F0871/F0871ART、F0870/F0870ART、F0758/F0758ART,且經(jīng)過real-time PCR檢測(cè)確定PfACS1a在抗性蟲株中表達(dá)下調(diào)。我們知道K13的突變使惡性瘧原蟲青蒿素抗性升高,那么該抗性是否引起PfACS1a表達(dá)量的變化?我們使用pARL質(zhì)粒分別構(gòu)建了帶有F446I、I543T、C580Y突變位點(diǎn)的K13基因重組質(zhì)粒,并分別命名為pARL-PfK13~(F446I mut)、pARL-PfK13~(I543T mut)、pARL-PfK13~(C580Y mut)。隨后將這些重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)染至K13基因未突變的野生型蟲株中,包括3D7~(wt)、FCC1/HN~(wt)、F0829~(wt),以構(gòu)建帶有不同突變位點(diǎn)的K13基因突變蟲株。通過單交換我們成功獲得了3D7~(F446I mut)、3D7~(I543T mut)、3D7~(C580Y mut)、FCC1/HN~(F446I mut)、FCC1/HN~(C580Y mut)和F0829~(C580Y mut)基因突變蟲株。收集基因突變蟲株及其親本蟲株的新鮮入侵紅細(xì)胞6h的環(huán)狀體RNA,反轉(zhuǎn)錄后通過qPCR的方法檢測(cè)PfACS1a表達(dá)量發(fā)現(xiàn)K13基因突變的蟲株P(guān)fACS1a的表達(dá)量相較于親本株均顯著下調(diào),初步證實(shí)PfK13基因突變可導(dǎo)致PfACS1a在蟲體中表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論,我們挑選了29份采集于緬甸拉咱地區(qū)的蟲株,其中12份是K13基因野生型,17份是K13基因突變型,qPCR檢測(cè)6h環(huán)狀體PfACS1a的表達(dá)量顯示:K13基因突變蟲株群體PfACS1a的表達(dá)量顯著低于K13基因野生型蟲株群體(***,p0.001)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:K13基因的突變使蟲體PfACS1a的表達(dá)量顯著降低。2、PI3K及其通路調(diào)控PfACS1a基因的表達(dá)以往研究表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PI3K-AKT-FOXO為經(jīng)典的信號(hào)通路,而在其他物種的相關(guān)報(bào)道中FOXO蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控脂肪酸的代謝。我們提出假設(shè):是否在惡性瘧原蟲中存在類似的信號(hào)通路,使PfACS1a的表達(dá)受到PfPI3K的調(diào)控。將PfPI3K的特異性抑制劑LY294002(50mM)和DHA(10nM)分別作用于環(huán)狀體時(shí)期的蟲體3h,而后收集蟲體并抽提RNA檢測(cè)PfACS1a的表達(dá)量。通過對(duì)12株蟲株在10nM DHA作用下PfACS1a的表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn):其表達(dá)水平相較于不加藥的對(duì)照組均有顯著升高。隨后,檢測(cè)了其中4株蟲株3D7~(wt)、3D7~(C580Y mut)、3D7~(I543T mut)、FCC1/HN ~(wt)加入PfPI3K特異性抑制劑LY294002作用3h后PfACS1a的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)相較于不加藥對(duì)照組顯著的升高(*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001)。據(jù)此推知:在惡性瘧原蟲中,PfACS1a可能受到PI3K及其所在通路的調(diào)控。3、PfACS1a的表達(dá)水平及其活性影響蟲體對(duì)DHA的敏感性PfACS1a低表達(dá)能夠降低蟲株對(duì)DHA的敏感性:通過上述實(shí)驗(yàn)我們初步證實(shí)了PfACS1a的表達(dá)水平與惡性瘧原蟲青蒿素抗性程度之間存在關(guān)聯(lián)。在此基礎(chǔ)上,我們分析了蟲株3D7~(wt)和3D7~(C580Y) ~(mut)的PfACS1a表達(dá)水平與其青蒿素的敏感性之間的關(guān)系。結(jié)果顯示:蟲株3D7~(wt)的PfACS1a表達(dá)水平是K13基因突變的3D7~(C580Y) ~(mut)蟲株的3倍,差異顯著(***,P≤0.001),而其在10nM DHA的作用下生存率為27.01%±0.30%顯著低于3D7~(C580Y) ~(mut)蟲株的43.58%±1.76%(*,P≤0.05)。同時(shí),在我們篩選出的青蒿素抗性蟲株F0871和F0871-ART中檢測(cè)到F0871的PfACS1a的表達(dá)量是青蒿素抗性蟲株F0871ART的2倍,差異顯著(***,P≤0.001),而F0871ART在10nM DHA作用下的生存率31.95%±2.55%顯著高于F0871的23.78%±1.72%(*,P≤0.05)。因此我們證實(shí):PfACS1a表達(dá)量下調(diào)能夠降低蟲株對(duì)DHA的敏感性。抑制PfACS1a的活性降低蟲株對(duì)DHA的敏感性:由于在惡性瘧原蟲中ACS具有多個(gè)基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)域高度相似的成員,因此采用基因敲除方法來驗(yàn)證PfACS1a功能的思路可能不適合本研究。我們選擇了ACS特異性抑制劑三氮菌素C(TriacsinC)進(jìn)行PfACS1a功能敲低。初步研究表明:TriacsinC在不影響蟲體正常生長的濃度下與DHA共同作用于蟲體3h可顯著降低DHA對(duì)蟲體的殺傷作用,提高蟲體的生存率。我們后續(xù)選擇了3個(gè)K13基因野生型蟲株,即3D7~(wt)、F08B-4和F08B-9驗(yàn)證我們的結(jié)論。結(jié)果顯示:DHA單獨(dú)作用于3D7~(wt)、F08B-4和F08B-9其生存率分別17.76%±1.62%、33.58%±0.42%和29.12%±1.58%,而4mM TriacsinC可顯著降低10nM DHA對(duì)蟲體的殺滅作用,使3D7~(wt)、F08B-4和F08B-9的生存率升高至27.15%±0.15%、39.13%±1.05%和37.9%±0.47%,差異顯著(*,P≤0.05,**,P≤0.01)。因此抑制ACS活性可降低惡性瘧原蟲對(duì)DHA的敏感性。過表達(dá)PfACS1a升高蟲株對(duì)DHA的敏感性:我們通過過表達(dá)PfACS1a來反向驗(yàn)證PfACS1a的表達(dá)量與青蒿素抗性相關(guān)。將PfACS1a的基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后連接到pLN質(zhì)粒上,構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pLN-PfACS1a~(mut)。隨后通過電轉(zhuǎn)染將過表達(dá)質(zhì)粒pLN-PfACS1a~(mut)和pLN空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入蟲株3D7~(C580Y) ~(mut)和F0871ART中,將PfACS1a過表達(dá)蟲株命名為3D7~(C580Y) ~(mut)-PfACS1a和F0871ART-PfACS1a。采用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明pLN-PfACS1a~(mut)質(zhì)粒在蟲體3D7~(C580Y) ~(mut)和F0871ART中成功表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48h的環(huán)狀體RNA并檢測(cè)PfACS1a的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)PfACS1a在蟲株3D7~(C580Y) ~(mut-)PfACS1a和F0871ART-PfACS1a中表達(dá)量顯著升高,較親本蟲株3D7~(C580Y) ~(mut)和F0871ART表達(dá)上調(diào)將近6000倍(***P≤0.001)。檢測(cè)蟲株3D7~(C580Y mut-)PfACS1a和F0871ART-PfACS1a生存率發(fā)現(xiàn):3D7~(C580Y) ~(mut-)PfACS1a的生存率25.04%±2.08%顯著低于(***,P≤0.001)3D7~(C580Y) ~(mut)的72.90%±2.72%和3D7~(C580Y) ~(mut)-pLN的61.63%±5.50%,同時(shí)也顯著低于原始蟲株3D7~(wt)的38.58%±1.59%(*,P≤0.05)。在F0871ART蟲株中也驗(yàn)證得到類似結(jié)果,即蟲株F0871ART-PfACS1a在10nM DHA作用下的生存率64.37%±1.46%顯著低于F0871ART(83.33%±0.67%)和F0871ART-pLN(68.18%±5.75%)(**,P≤0.01),但與原始株F0871(62.99%±2.11%)差異不顯著,說明PfACS1a的過表達(dá)使青蒿素抗性蟲株F0871ART對(duì)青蒿素的敏感性恢復(fù)到與親本株F0871相同。該結(jié)果證明,PfACS1a的表達(dá)量升高可提高蟲株對(duì)DHA的敏感性。4、PfACS1a通過活性氧生成、線粒體膜電勢(shì)去極化和蟲體DNA斷裂影響蟲體生存PfACS1a的表達(dá)水平和活性影響蟲株在DHA作用下ROS生成量:熒光探針DCFH-DA的熒光強(qiáng)度代表蟲體ROS的生成量,熒光強(qiáng)度越高,ROS的生成量越高。對(duì)相同原蟲率、紅細(xì)胞壓積的蟲株3D7~(wt)/3D7~(C580Ymut)、F0870/F0870ART在10nM DHA作用下ROS的生成量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),蟲株3D7~(C580Ymut) ROS的生成量19050.64±24.96顯著低于3D7~(wt)19555.5±66.5(*,P≤0.05),同樣地,F0870ART ROS的生成量27284.75±270.27也顯著低于F0870的生成量28118.67±297.32(*,P≤0.05)。以上研究結(jié)果證實(shí):下調(diào)PfACS1a的表達(dá)導(dǎo)致DHA作用下ROS的生成量降低。同時(shí)通過10nM DHA作用下蟲體的生存率的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3D7~(C580Ymut)的生存率是3D7~(wt)的1.61倍(*,P≤0.05),F0870ART的生存率是F0870的1.67倍(***,P≤0.001)。而對(duì)過表達(dá)蟲株3D7~(C580Ymut)-PfACS1a和F0871ART-PfACS1a在DHA作用下ROS的生成量檢測(cè)結(jié)果顯示PfACS1a過表達(dá)使蟲株在DHA作用下ROS的生成量顯著升高(***,P≤0.001)。以上研究證實(shí):PfACS1a的表達(dá)水平通過影響蟲體在DHA作用下ROS的生成量進(jìn)而影響蟲體對(duì)DHA的敏感性。那么PfACS1a的活性對(duì)蟲體ROS的生成量是否產(chǎn)生影響?我們通過預(yù)實(shí)驗(yàn)初步得出TriacsinC能夠顯著降低DHA作用下蟲體ROS的生成量,但隨著DHA濃度的升高,這種能力逐漸減弱。根據(jù)上述結(jié)果,我們后續(xù)選擇了3D7~(wt)、F0829、F08B-4三個(gè)K13基因野生型蟲株進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示三個(gè)蟲株在4mM TriacsinC和10nM DHA共同作用下ROS的生成量分別為9564.33±272.36、10901.00±174.74和37564.67±101.67顯著低于DHA單獨(dú)作用蟲體ROS的生成量11489.00±78.62、13038.67±51.07和39145.33±393.42(*,P≤0.05,***,P≤0.001)。以上研究證實(shí):抑制PfACS的活性能夠減少DHA作用于蟲體時(shí)ROS的生成量,從而導(dǎo)致蟲體對(duì)青蒿素的敏感性降低。綜上我們得出結(jié)論:PfACS1a的表達(dá)水平和活性影響蟲株在DHA作用下ROS生成量。PfACS1a的表達(dá)水平和活性影響蟲體線粒體膜電勢(shì)去極化:根據(jù)上述研究我們推測(cè)PfACS1a通過影響ROS的生成進(jìn)而影響蟲體的凋亡過程。熒光探針TMRE的熒光強(qiáng)度代表線粒體膜電勢(shì)去極化的程度,熒光強(qiáng)度越低,蟲體線粒體膜電勢(shì)去極化程度越高。預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:10nM DHA能夠使蟲體的線粒體膜電勢(shì)去極化程度顯著升高(***,P≤0.001)。我們選擇PfACS1a表達(dá)水平顯著下調(diào)的3D7~(C580Ymut)和F0871ART檢測(cè)其在相同原蟲率和紅細(xì)胞壓積條件下,10nM DHA作用蟲體后線粒體膜電勢(shì)的去極化水平。結(jié)果顯示:下調(diào)PfACS1a的表達(dá)可顯著降低蟲體在DHA作用下線粒體膜電勢(shì)的去極化程度(*,P≤0.05,**,P≤0.01)。而后我們分別將蟲株3D7~(wt)、3D7~(C580Ymut)、F0871和F0871ART的PfACS1a的活性用4mM TriacsinC進(jìn)行抑制再檢測(cè)蟲株在10nM DHA作用下線粒體膜電勢(shì)去極化的程度。結(jié)果顯示:PfACS1a的活性受到抑制能夠顯著降低DHA造成的蟲體線粒體膜電勢(shì)去極化的程度(*,P≤0.05,***,P≤0.001)。綜上所述:PfACS1a的表達(dá)水平和活性影響蟲體在DHA作用下線粒體膜電勢(shì)去極化的程度。DHA使蟲體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高:線粒體膜電勢(shì)的去極化是凋亡的早期標(biāo)志。為驗(yàn)證蟲體是否發(fā)生凋亡,我們對(duì)DHA作用蟲體后的caspase類似蛋白MCA1和MCA2表達(dá)水平進(jìn)行qPCR檢測(cè)。結(jié)果表明:10nM DHA作用蟲株3D7~(wt)、3D7~(I543Tmut)和3D7~(C580Ymut) 3h后MCA1上調(diào)了2.25、1.4和2.2倍,3D7~(wt)和3D7~(C580Ymut)的MCA2的表達(dá)量分別上調(diào)了1.2和2.0倍,其中3D7~(I543Tmut)蟲株的MCA2差異不顯著,其他均有顯著差異(*,P≤0.05,**,P≤0.01)。而這些凋亡相關(guān)蛋白過表達(dá)后是否發(fā)揮了功能?我們選擇多種caspase功能抑制劑——Z-VAD-FMK,并將其與10nM DHA共同作用于蟲體3h后檢測(cè)蟲體的生存率。研究結(jié)果顯示:Z-VAD-FMK可顯著提高DHA作用下蟲體的生存率(**,P≤0.01,***,P≤0.001)。綜上證明:DHA作用于蟲體上調(diào)蟲體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響蟲體對(duì)DHA的敏感性。抑制PfACS1a活性顯著減少DHA引起的蟲體DNA的斷裂:為進(jìn)一步證實(shí)PfACS1a影響蟲體凋亡過程,我們采用TUNEL檢測(cè)試劑盒對(duì)DHA作用下蟲體DNA的斷裂情況進(jìn)行了檢測(cè)。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)的條件摸索我們確定了20nM DHA能夠使蟲體的DNA斷裂比例顯著高于對(duì)照組(***,P≤0.001)。而使用4mM TriacsinC抑制劑與20nM DHA同時(shí)作用于蟲體使DNA的斷裂比例從DHA單獨(dú)作用蟲體的11.13%±0.88%降低到6.53%±0.19%,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*,P≤0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):DHA能作用于蟲體導(dǎo)致其DNA斷裂死亡,而抑制PfACS1a的活性能夠降低DHA造成的蟲體DNA的斷裂程度。小結(jié):本課題前期工作已培育了惡性瘧原蟲青蒿素抗性蟲株,通過轉(zhuǎn)錄譜的分析初步表明了青蒿素抗性蟲株的PfACS1a基因表達(dá)下調(diào)。在此基礎(chǔ)上,本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù),構(gòu)建帶有F446I、I543T、C580Y的K13基因突變的青蒿素抗性蟲株,并證實(shí)這些抗性蟲株的PfACS1a基因表達(dá)下調(diào)。此外,K13基因突變的地理株,其PfACS1a表達(dá)顯著低于無突變的野生株,這些結(jié)果表明,PfACS1a基因表達(dá)水平與青蒿素抗性相關(guān)聯(lián)。本研究初步闡明了惡性瘧原蟲青蒿素抗性的相關(guān)機(jī)制:PfK13的基因突變導(dǎo)致其與PfPI3K的結(jié)合減少,從而使PfPI3K泛素化降低降解減少,使PfPI3K在蟲體中積聚,通過一定的調(diào)控通路導(dǎo)致PfACS1a表達(dá)下調(diào)。PfACS1a表達(dá)量下調(diào)和活性被抑制可使蟲體在DHA作用下生成的ROS減少,進(jìn)而使蟲體的線粒體膜電勢(shì)去極化的程度降低。蟲體在DHA壓力作用下caspase相似蛋白表達(dá)量升高并激活,使蟲體DNA斷裂導(dǎo)致蟲體死亡,而抑制PfACS1a的活性則可顯著降低DNA斷裂的比例,從而使蟲體的生存率提高。本研究首次證實(shí)PfACS1a可能是惡性瘧原蟲產(chǎn)生青蒿素抗性的關(guān)鍵抗性分子,全面深入闡明PfACS1a在青蒿素抗性分子機(jī)制中的具體功能,將為瘧疾防治提供新的研究思路和藥物靶點(diǎn)。
【圖文】：

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的以周期性規(guī)律發(fā)作，全身發(fā)冷、發(fā)熱、多汗，作后，引起貧血和脾腫大為主要特征的寄生蟲病。瘧疾的病原體主要包括（Plasmodium falciparum）、間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）、三日瘧lasmodium malariae）和卵形瘧原蟲（Plasmodium ovale）[1]。從2000年至2的發(fā)病率和死亡率均顯著降低。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)：2000年全球范圍內(nèi)人口是2.62億，，死亡人口約84萬，而2015年發(fā)病人口是2.14億，死亡人口約期間發(fā)病人口降低了37%，死亡人口降低了60%（圖1）。而這些瘧疾的發(fā)88%的病例來自非洲地區(qū)，10%來自東南亞地區(qū)，2%來自地中海東部地區(qū)口中有90%的病例來自非洲地區(qū)，7%來自東南亞，2%來自地中海東部地起的5歲以下兒童死亡數(shù)量從2000年的72.3萬人減少到2015年的30.6萬人[2]顯示雖然瘧疾在全球范圍內(nèi)得到了廣泛的控制，但目前世界范圍內(nèi)居住在區(qū)的人口仍有33億之多[3]。瘧疾這一古老的寄生蟲病依然嚴(yán)重威脅著人類康，其中對(duì)人類危害最大的、致死性的是能夠引起腦型瘧和重度貧血的惡

顯示柬埔寨、緬甸、泰國、越南、老撾地區(qū)均出現(xiàn)了青蒿素抗性蟲株[8-10]（圖2）。歷史上大湄公河流域也是眾多傳統(tǒng)抗瘧藥物最先出現(xiàn)抗性的地區(qū)，隨后抗性蟲株傳播進(jìn)入非洲、拉丁美洲等地區(qū)，給人類生命健康和世界經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失，使全球瘧疾的發(fā)病率和死亡率均升高[12-17]。這樣的傳播速度不禁使我們擔(dān)憂一旦抗性蟲株傳入非洲地區(qū)那將會(huì)造成巨大的災(zāi)難。但是由于蟲體清除時(shí)間的檢測(cè)方法受到諸多因素的制約，使我們無法及時(shí)檢測(cè)所有感染病例�？蒲腥藛T發(fā)明了一種體外環(huán)狀體生存實(shí)驗(yàn)（RSA0-3h）：即通過將0-3h的惡性瘧原蟲環(huán)狀體暴露于700nM濃度的DHA下作用6h，6h后洗去藥物并繼續(xù)培養(yǎng)66h后進(jìn)行原蟲率計(jì)數(shù)，通過和未加藥對(duì)照組原蟲率進(jìn)行比較以判定蟲株是否出現(xiàn)抗性[18]。該方法能夠既簡便又有效地于體外檢測(cè)蟲株在青蒿素藥物壓力下的生存率，使研究人員能夠很方便地進(jìn)行體外大量檢測(cè)，并判定蟲株是否產(chǎn)生青?
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R382.31

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1 王潔 ,袁凱;var基因在單個(gè)惡性瘧原蟲中的鑲嵌樣轉(zhuǎn)錄[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2004年02期

2 張小萍;抗惡性瘧原蟲再感染的影響因素[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2001年01期

3 毛家都;惡性瘧原蟲熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法的建立[J];中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào);2000年09期

4 高馨;惡性瘧原蟲穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));1998年04期

5 高琪;聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)蚊內(nèi)惡性瘧原蟲[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));1994年03期

6 陳克涌;;印度Gadchiroli區(qū)的惡性瘧原蟲對(duì)甲氟喹和氯喹的體外微測(cè)試驗(yàn)比較[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));1987年01期

7 李軍;;岡比亞惡性瘧原蟲對(duì)乙胺嘧啶、邁咯平(Maloprim)和氯喹的敏感性[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));1987年02期

8 楊元清;;嚙齒類瘧疾的化療XXXIX.用青蒿素治療后,小鼠體內(nèi)伯氏瘧原蟲超微結(jié)構(gòu)的變化以及在體外~8H-雙氫青蒿素在惡性瘧原蟲體內(nèi)定位的觀察[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));1987年02期

9 劉瑞君;;惡性瘧原蟲對(duì)藥物敏感性的一種新的溴乙錠熒光測(cè)定技術(shù)[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));1987年02期

10 張世民;;連續(xù)的重復(fù)順序是惡性瘧原蟲上紅細(xì)胞受體結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1987年01期

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1 徐勁;葉苓;吳忠道;陳守義;余新炳;;惡性瘧原蟲己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因的初步研究[A];中國動(dòng)物學(xué)會(huì)第七屆全國青年寄生蟲學(xué)工作者學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2002年

2 雷俊川;繆軍;李s

本文編號(hào)：2591259