【摘要】：模式生物果蠅是研究疾病及器官發(fā)育機制的重要模型。果蠅腸道和人類具有高度相似性,以果蠅腸道為研究對象可為揭示人類腸道疾病發(fā)生及損傷修復機制提供重要的參考。目前為止,關于果蠅中腸的發(fā)育機制已有很多深入的研究,而果蠅后腸的研究卻相對較少。果蠅后腸形成過程中受哪些重要的信號調(diào)控?在蛹期器官解離和成蟲組織重構(gòu)的過程中,幼蟲后腸腸細胞的命運如何,是發(fā)生凋亡還是存活下來并參與成蟲后腸的重構(gòu)?目前這些關于后腸相關功能機制的探究都少為人熟知。我們都知道干細胞負責調(diào)控所在部位的組織命運和器官維護,那后腸干細胞在組織受損時將如何修復損傷?Gal4/UAS系統(tǒng)是果蠅中常用的轉(zhuǎn)基因體系,利用Gal4/UAS系統(tǒng)可以實現(xiàn)區(qū)域化的靈活操控的靶基因表達。為了更清晰地示蹤細胞譜系的增殖分化模式和細胞群落的遷移分布狀態(tài),本研究使用新的遺傳學細胞譜系示蹤技術(shù):G-TRACE(Gal4 technique for real-time and clonal expression)技術(shù),即在Gal4/UAS系統(tǒng)的基礎上結(jié)合FLP(flipase)-out技術(shù)和熒光蛋白標記技術(shù),可以清楚地分析發(fā)育過程中的細胞譜系模式。本研究將利用G-TRACE技術(shù)探究后腸的腸細胞發(fā)育譜系及其形成的信號調(diào)控機制、干細胞在受損后腸中的修復模式。主要研究內(nèi)容如下:一:利用G-TRACE技術(shù)追蹤果蠅后腸腸細胞譜系的發(fā)育模式采用黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)engrailed-Gal4(en-Gal4)品系和G-TRACE品系雜交,同時引入tub-Gal80~(ts)控制Gal4的開啟時間,分別在果蠅幼蟲期和蛹期開啟細胞譜系追蹤。幼蟲期追蹤:親代產(chǎn)卵后將卵置于30℃培養(yǎng),3齡中后期轉(zhuǎn)入18℃培養(yǎng),成蟲羽化1 d內(nèi)解剖腸道并觀察。蛹期追蹤:親代產(chǎn)卵后將卵置于18℃培養(yǎng),在蛹期不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)入30℃培養(yǎng),待蟲體羽化后檢測成蟲腸道的追蹤情況。當在果蠅幼蟲期啟動細胞譜系追蹤,在蛹期停止追蹤,發(fā)現(xiàn)成蟲中腸靠近中后腸邊界處以及馬氏管存在綠色腸細胞。而當在果蠅幼蟲期關閉細胞譜系追蹤,在蛹期開始追蹤,則發(fā)現(xiàn)蟲體中腸各部位及馬氏管分布著綠色腸細胞,en基因在果蠅蛹期的腸道表達。結(jié)果表明在果蠅蛹形成過程中,幼蟲期后腸腸細胞并非完全凋亡,而是有一部分遷移至中腸或馬氏管,參與成蟲中腸或馬氏管的重塑。二:G-TRACE手段追蹤果蠅后腸形成的信號調(diào)控機制Sheng-An Yang等認為幼蟲的“成蟲環(huán)”區(qū)域(文中稱為“the imaginal ring”,位于后腸幽門)是幼蟲組織中的祖細胞區(qū),影響著成蟲后腸組織的生成。以hh--Gal4,wg-Gal4,ptc-Gal4,ci-Gal4,dpp-Gal4,notch-Gal4品系分別與G-TRACE品系雜交,同時引入tub-Gal80~(ts)控制Gal4的開啟時間。對雜交子代的幼蟲及成蟲模式、追蹤幼蟲期激活的GFP細胞(基因表達細胞)后最終對成蟲后腸組織的貢獻量等做出分析探究。最終我們得出結(jié)論,幼蟲期ci表達的區(qū)域即定位于“成蟲環(huán)”,也就是幼蟲的祖細胞區(qū),幼蟲期Hh信號在幽門部位緊鄰“ci祖細胞區(qū)”檢測到,Wg和Dpp(Ptc)信號位于成蟲后腸增殖區(qū)(hindgut proliferation zone,HPZ),Wg和Dpp(Ptc)信號之間可能互相有關聯(lián)并作用于成蟲后腸增殖區(qū)。三:后腸損傷組織的修復機制對后腸腸細胞的命運及其形成的信號調(diào)控機制做分析結(jié)論之后,我們接著探究果蠅后腸干細胞對損傷組織的修復機制。研究采用bam-Gal4,vasa-Gal4,wg-Gal4品系驅(qū)動G-TRACE品系,引入tub-Gal80~(ts)控制Gal4的開啟和關閉。用20%-40%濃度梯度的NaCl溶液加入培養(yǎng)基中對果蠅成蟲進行損傷,并用生殖細胞(Germline Cells)標記物對“wg環(huán)”區(qū)域進行檢測,“wg環(huán)”區(qū)域也即是位于成蟲HPZ區(qū)。最終研究結(jié)果顯示,由無NaCl溶液加入的正常培養(yǎng)基飼養(yǎng)的果蠅后腸“wg環(huán)”區(qū)域并未檢測到生殖細胞標記物,并且在成蟲后腸組織中也未發(fā)現(xiàn)表達EGFP的wg細胞,因正常狀態(tài)下后腸組織中的干細胞處于靜默狀態(tài)。而被NaCl溶液損傷的后腸解剖后不僅檢測到生殖細胞標記物,同時在后腸組織中發(fā)現(xiàn)了表達EGFP的wg細胞的移動行跡,EGFP細胞流以特殊的軌道形式向后腸后部部位移動,可見腸道干細胞在行使其功能時是沿著一定的移動軌跡來修復補充受損部位的。
【圖文】：

在世界各地均可以尋找到其描述以來，以黑腹果蠅（Drosophil為了人類最為青睞的手段之一。黑腹Diptera）昆蟲，具有完全變態(tài)，其下，10 天就可以完成一代的繁殖（齡 1 天，二齡 1 天，三齡 1 天），，后破蛹羽化為成蟲[2-3]。以黑腹果蠅，使用經(jīng)濟：在常溫條件下使用較且子代多：縮短了實驗周期，使實驗全：只有 4 對染色體，另外還有許數(shù)次的雜交, 確定了基因里面的基因4. 與人類有很大關聯(lián)：關于果蠅的這些優(yōu)勢都使得黑腹果蠅成為最常用

果蠅后腸發(fā)育信號調(diào)控機制及細胞譜系模式研究 Gal4/UAS 系統(tǒng)為基礎統(tǒng)統(tǒng)是果蠅實驗研究中最常用的轉(zhuǎn)基因系之一。其基本子，使得靶標基因可以特異性的在特定部位進行表達統(tǒng)構(gòu)成：Gal4 轉(zhuǎn)基因系和 UAS 轉(zhuǎn)基因系[11]，Gal4 體系中獨立存在[7-8]。Gal4（Galactose 4）是一種轉(zhuǎn)錄員發(fā)現(xiàn)果蠅 Gal4 可以激活 UAS（upstream activatin-9]。UAS 是上游激活序列，是酵母中類似于真核生物的識別并結(jié)合 DNA 序列 UAS 的特異性位點并激活 UAS 品系雜交以獲得兩種轉(zhuǎn)基因序列是實驗常用獨特優(yōu)勢之處[10-11]。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R-332

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本文編號：2591147