【摘要】：白介素-1受體輔助蛋白(Interleukin-1 Receptor Accessory Protein,IL1RAP)是參與白介素-1家族因子多種信號傳導途徑的共受體。其中,IL1RAP在慢性髓性白血病的干細胞表達,但在正常造血干細胞中不表達;在急性髓性白血病和骨髓增生異常綜合征患者的原始細胞上,IL1RAP的表達量也顯著增加。IL1RAP已被證明可作為多種癌癥的細胞表面標志物,尤其是血液癌癥。因此,以IL1RAP為靶點開發(fā)抗體藥物治療白血病具有樂觀前景。利用柔性多肽鏈將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)連接形成單鏈抗體(scFv),既保留了與抗原發(fā)生特異性結合的最小結構單元又降低了免疫排斥反應,在免疫治療領域極具應用優(yōu)勢。本課題綜合利用噬菌體展示技術和酵母表面展示技術從人源化的單鏈抗體庫中篩選針對IL1RAP靶點的單鏈抗體,并分析其特性。我們首先利用鏈霉親和素與生物素結合的原理,將人源單鏈抗體庫經(jīng)過2輪噬菌體淘選,利用ELISA檢測確定2輪淘選后的抗體庫具有明顯的陽性富集。富集的噬菌粒載體經(jīng)酶切純化獲得scFv片段,構建成為酵母展示亞文庫。利用Aga1-Aga2的酵母展示系統(tǒng)經(jīng)過3輪酵母表面展示及流式細胞分選,逐級富集高親和力的單鏈抗體。篩選獲得的IL1RAP單鏈抗體片段經(jīng)DNA測序確定其序列。將篩選得到的IL1RAP單鏈抗體DNA克隆到pFuse載體,利用293F細胞表達含F(xiàn)c段的scFv蛋白。單鏈抗體經(jīng)protein A蛋白柱親和層析純化。同時,我們利用CRISPR-Cas9編輯技術敲除IL1RAP,獲得了不表達IL1RAP的293F穩(wěn)定細胞株。利用IL1RAP敲除株和野生型293F細胞驗證候選單鏈抗體結合IL1RAP的特異性,最終獲得2個具有較高親和力的IL1RAP單鏈抗體序列。綜上,本課題通過噬菌體和酵母展示篩選技術獲得了針對IL1RAP靶點的單鏈抗體,證實篩選得到的單鏈抗體與IL1RAP具有良好的親和力。為靶向IL1RAP蛋白的白血病等疾病免疫治療奠定了良好基礎。
【圖文】：

細介紹了 IL-1R 家族的 10 種受體的命名以及作用機制，，IL-1α、I 以及 IL1RAP 引發(fā)免疫炎癥反應；IL-18 結合 IL-1R7 引發(fā)炎癥反應4、IL1RAP 引發(fā)炎癥反應；IL-36α、IL-36β、IL-36γ 結合 IL-1R6 與 應。族的促炎性因子（除 IL-18），在進行信號傳導過程中，首先與細結合形成受體復合物結構，但此時并不具備向細胞內(nèi)傳遞信號的能表面的共有結構白介素-1 受體輔助蛋白（IL1RAP，又稱 IL-）形成異源三聚體結構進而進行信號傳遞，引發(fā)細胞的炎癥反應[5]（

刺激小鼠后并沒有產(chǎn)生人們預期的特異性抗體[14]。這些問題的存在單鏈抗體的研究與開發(fā)�？贵w分子由 4 條多肽鏈構成，包括 2 條重鏈和 2 條輕鏈，鏈與鏈之當完整的抗體分子經(jīng)木瓜蛋白酶消化后，得到兩個完整的抗原結合由重鏈恒定區(qū) 2 和 3 組成的 Fc 段。Fab 片段還能夠通過酶解的方結構單位 Fv。Fv 片段由抗體分子的重鏈可變區(qū)（VH）與輕鏈可變價鍵連接，是與抗原發(fā)生特異性結合的最小結構單元。而單鏈抗體因工程的手段得到的，它是利用一個柔性的多肽鏈將抗體分子的重變區(qū)連接在一起，并且這條多肽鏈需包括至少 12 個氨基酸殘基，體與抗原結合的三維構象[15]。最常用的連接肽鏈是甘氨酸與絲氨。
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2590451