【摘要】：癌癥的過(guò)程研究闡明了癌癥的發(fā)生、發(fā)展及其演變過(guò)程中的相關(guān)機(jī)理,對(duì)癌癥的診斷、干預(yù)和治療具有指導(dǎo)性作用,其中,對(duì)癌癥的相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測(cè)是癌癥的過(guò)程研究中最有效的途徑之一。核酸是一種非常重要的癌癥標(biāo)志物,對(duì)其進(jìn)行有效篩查和高靈敏檢測(cè)對(duì)癌癥的過(guò)程研究和控制具有十分重要的意義。因此,對(duì)復(fù)雜樣品中的痕量核酸進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)受到了越來(lái)越多的關(guān)注,尤其是核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。自1990年以來(lái),大量的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法被陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái),并且被廣泛應(yīng)用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)等的檢測(cè)。其中,基于切口內(nèi)切酶(Nicking Endonucleases,NEases)的等溫?cái)U(kuò)增方法,如鏈置換擴(kuò)增(Strand Displacement Amplification,SDA)、指數(shù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(Exponential Isothermal Amplification Reaction,EXPAR)和切口內(nèi)切酶信號(hào)放大(Nicking Endonuclease SignalAmplification,NESA)等由于簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)始終是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。但是,NEases對(duì)目標(biāo)核酸分子中特定識(shí)別序列的依賴構(gòu)成了這類方法的瓶頸,因此,如何向擴(kuò)增體系中引入NEases的特異性識(shí)別位點(diǎn)仍是這些方法面臨的共同挑戰(zhàn);另外,對(duì)制約等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)靈敏度的非特異性擴(kuò)增效應(yīng)的有效抑制也是非常棘手的難題。針對(duì)上述問(wèn)題,本論文首先發(fā)展了一種DNA定位探針(DNA-Aligner,DA)介導(dǎo)剪切技術(shù)(Aligner-MediatedCleavage,AMC),克服了 NEases對(duì)目標(biāo)核酸分子中特定識(shí)別序列的依賴問(wèn)題;在此基礎(chǔ)上,提出了基于AMC的兩種新型等溫指數(shù)擴(kuò)增方法,并對(duì)新方法中存在的非特異性擴(kuò)增效應(yīng)進(jìn)行研究和抑制,進(jìn)一步提高了方法的穩(wěn)定性和靈敏度;此外,還利用DA介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和空間位阻效應(yīng)建立了一種簡(jiǎn)便、快速和均相的蛋白檢測(cè)方法。主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面:第一章概述了近年來(lái)發(fā)展的主要等溫?cái)U(kuò)增方法。重點(diǎn)闡述、分析了基于NEases的等溫?cái)U(kuò)增方法的原理、應(yīng)用和存在的問(wèn)題,并在此基礎(chǔ)上提出了本論文的研究?jī)?nèi)容。第二章發(fā)展了 一種定位探針介導(dǎo)剪切技術(shù)(AMC)。定位探針(DA)包括莖-環(huán)結(jié)構(gòu)和兩單鏈側(cè)臂,其中莖上含有NEases的識(shí)別位點(diǎn);NEases首先結(jié)合在DA莖的識(shí)別位點(diǎn)上,再通過(guò)DA兩側(cè)臂與目標(biāo)序列的雜交被定位至待剪切位點(diǎn)處進(jìn)而實(shí)施剪切。該方法克服了 NEases對(duì)目標(biāo)核酸分子中特異性識(shí)別位點(diǎn)的依賴,僅使用一種NEase,通過(guò)調(diào)節(jié)DA在目標(biāo)序列上的雜交位置就可以實(shí)現(xiàn)在任一位置處的精確剪切,且剪切位點(diǎn)可以逐個(gè)堿基調(diào)節(jié)。第三章采用AMC技術(shù)發(fā)展了一種新型等溫鏈置換擴(kuò)增方法(Aligner-Mediated Cleavage-Based Strand Displacement Amplification,AMC-SDA)。相較于傳統(tǒng)的SDA,AMC-SDA具有以下特點(diǎn):由于AMC優(yōu)異的通用性,該方法也具備很強(qiáng)的通用性,理論上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列中的任一片段的擴(kuò)增和檢測(cè);引物的3'封端處理在一定程度上抑制了“引物二聚體”效應(yīng),可以獲得較高的靈敏度,此外引物設(shè)計(jì)也因此大幅簡(jiǎn)化。對(duì)質(zhì)粒和實(shí)際HBVDNA良好的檢測(cè)性能證明了AMC-SDA具有很好的應(yīng)用前景。第四章對(duì)AMC-SDA進(jìn)行了優(yōu)化,進(jìn)一步提高了方法的檢測(cè)靈敏度和重現(xiàn)性。通過(guò)對(duì)DA的改進(jìn)和在引物中引入硫化和脫堿基位點(diǎn)等手段,消除了 DA/引物沿著目標(biāo)序列延伸對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增的不利影響、抑制了 DA/引物3'封端的降解和體系的非特異性擴(kuò)增效應(yīng),可將AMC-SDA的檢測(cè)下限降低至10-17M水平,且方法的重現(xiàn)性也大幅提高。第五章采用AMC技術(shù)發(fā)展了 一種新型指數(shù)等溫?cái)U(kuò)增方法(AMC-Triggered Exponential Amplification,AMCEA)。相較于傳統(tǒng) EXPAR,由于 AMC 可以在任一位點(diǎn)處將目標(biāo)序列剪切以產(chǎn)生觸發(fā)引物,因此AMCEA具有十分優(yōu)異的通用性,可以更靈活地應(yīng)用于各種核酸片段的擴(kuò)增和檢測(cè),其對(duì)血清中目標(biāo)DNA的檢測(cè)結(jié)果也證明了該方法具有一定的應(yīng)用潛力。第六章將DA可調(diào)節(jié)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)速率的特性與空間位阻效應(yīng)相結(jié)合,提出了一種空間位阻效應(yīng)調(diào)節(jié)的等溫?cái)U(kuò)增方法(Steric Effect-RegulatedEXPAR,SER-EXPAR)并用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)。SER-EXPAR可以高特異性地檢測(cè)納摩爾濃度的目標(biāo)蛋白,是一種一步、快速和均相的蛋白檢測(cè)方法,其對(duì)血清中目標(biāo)蛋白的檢測(cè)結(jié)果也證明了該方法具有一定的應(yīng)用潛力。第七章對(duì)本論文的創(chuàng)新點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)并對(duì)以后的研究提出了展望。
【圖文】：

另一種重要的變溫妒■增技術(shù)是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Ｌｉ邋ｇａｓｅ邋Ｃｈａｉｎ邋Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＬＣＲ邋），逡逑由Ｂａｒａｎｙ于１９９１年發(fā)明［１３，１４］，主要目的是檢測(cè)靶序列中的基因位點(diǎn)突變，其基逡逑本過(guò)程如圖１．２所示。耐熱型（９４。０連接酶的使用不但抑制了邋ＬＣＲ的非特異逡逑性擴(kuò)增，還避免了與早期ＰＣＲ類似的不斷補(bǔ)充酶的復(fù)雜操作過(guò)程。ＬＣＲ是檢測(cè)逡逑靶序列中有無(wú)突變的最佳方法之一，目前主要用于癌癥基因的點(diǎn)突變、單堿基遺逡逑傳病多態(tài)性的研究、定向誘變以及微生物病原體的檢測(cè)等［１５邋＿邋１７１。逡逑完傘Ｉｆ．補(bǔ)靶序《邐屾ｆｆｉ錯(cuò)配序列逡逑Ｋ邋ｉＨＣ．受性－＾邐；邋Ａ邐，邋－ｙ邋ｓ邐邐邐：＝＾＝＾邋ｙ逡逑＝邐ｊ邋＾邐ｒ邐邐．！邋ｆ逡逑舫ｔ退火聚交邐？邐＾逡逑ＶＳ－邋ＶＸ邋＇Ｏ－Ｊｉ邋邐ｉ邐Ｊ邋Ｃ７？■—邋．＇Ｊ逡逑Ｊ＝｜＝２＝３邋５邐￣邋＇邐邐＾逡逑２、

ｉ逡逑２０－３０次插環(huán)擴(kuò)增逡逑？圖１．１邋ＰＣＲ技術(shù)原理示意圖。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ＰＣＲ．逡逑提高，并逐漸發(fā)展成為核酸研究領(lǐng)域最重要的方法之一。之后，一系列基于ＰＣＲ逡逑的核酸擴(kuò)增方法被陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái)［６—１２］，大大豐富了邋ＰＣＲ技術(shù)的實(shí)現(xiàn)手段。逡逑另一種重要的變溫妒■增技術(shù)是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Ｌｉ邋ｇａｓｅ邋Ｃｈａｉｎ邋Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＬＣＲ邋），逡逑由Ｂａｒａｎｙ于１９９１年發(fā)明［１３，，１４］，主要目的是檢測(cè)靶序列中的基因位點(diǎn)突變，其基逡逑本過(guò)程如圖１．２所示。耐熱型（９４。０連接酶的使用不但抑制了邋ＬＣＲ的非特異逡逑性擴(kuò)增，還避免了與早期ＰＣＲ類似的不斷補(bǔ)充酶的復(fù)雜操作過(guò)程。ＬＣＲ是檢測(cè)逡逑靶序列中有無(wú)突變的最佳方法之一，目前主要用于癌癥基因的點(diǎn)突變、單堿基遺逡逑傳病多態(tài)性的研究、定向誘變以及微生物病原體的檢測(cè)等［１５邋＿邋１７１。逡逑完傘Ｉｆ．補(bǔ)靶序《邐屾ｆｆｉ錯(cuò)配序列逡逑Ｋ邋ｉＨＣ．受性－＾邐；邋Ａ邐，邋－ｙ邋ｓ邐邐邐：＝＾＝＾邋ｙ逡逑＝邐ｊ邋＾邐ｒ邐邐．！邋ｆ逡逑舫ｔ退火聚交邐？邐＾逡逑ＶＳ－邋ＶＸ邋＇Ｏ－Ｊｉ邋邐ｉ邐Ｊ邋Ｃ７？■—邋．＇Ｊ逡逑Ｊ＝｜＝２＝３邋５邐￣邋＇邐邐＾逡逑２、
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.4;R3416

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本文編號(hào)：2589372