【摘要】：背景ENU化學誘變是正向遺傳學中最經(jīng)典高效的方式,是識別新基因并用以解析哺乳動物免疫系統(tǒng)分子基礎的強有力工具。T細胞作為機體適應性免疫的主要細胞群,承擔著輔助機體抵抗病原體入侵、防御感染的重要作用。CD4蛋白是T細胞活化的共受體,結構性研究已說明T細胞表面存在著CD4的四個胞外域,其中就包括與MHCII配體相連的第一個胞外域。但是關于活體模型中CD4胞外域與MHCII的聯(lián)系發(fā)生機制,目前尚沒有明確的研究和報道。目的利用ENU誘變在常用近交系小鼠C57BL/6J品系中建立免疫缺陷小鼠模型,探究得到的CD4輔助T淋巴細胞完全缺失表型的分子機制,在活體中研究CD4第一個胞外域的關鍵作用,以期建立研究CD4 T細胞的最佳小鼠模型。方法1.以近交系小鼠的典型代表C57BL/6J品系作為基因誘變的對象。選取8周齡的C57BL/6J雄鼠30只進行腹腔ENU注射誘變,注射劑量為90mg/kg體重,按照每周一次的注射方式,連續(xù)注射三次。待經(jīng)過誘變處理的雄鼠度過不育期,長至15周齡時,與野生型C57BL/6J雌鼠1:1進行合籠交配,作為G0構建加系。待生產(chǎn)的同一窩G1在哺育期結束后進行雌雄交配得到G2,再將同一窩生產(chǎn)的G2交配最終得到帶有純合突變的G3,即后續(xù)進行表型分析的活體對象。2.利用眼內眥靜脈采血法取G3代小鼠抗凝血約100μl,取30μl血樣與10μl抗體mix在流式管中混勻,冰上孵育30min;向其中加入400μl用蒸餾水與10xBD FACS裂解液稀釋成的1x裂解液,室溫避光孵育10min以裂解紅細胞;流式上樣分析。3.設計突變的Cd4基因序列,利用限制性內切酶克隆到哺乳動物表達載體PCI-Neo,得到瞬轉質粒:pCI-mCD4。將與Cd4基因共表達的T2A-EGFP片段克隆到同樣的酶切位點,得到最終的轉染質粒pCI-mCD4-EGFP。4.將質粒及對照分別導入人HEK 293T細胞,轉染24小時后在熒光顯微鏡下查看轉染情況,并進行流式熒光檢測。5.取CD3e敲除(CD3-/-)的小鼠作為受體對照,用磁珠試劑盒將Ly5.1Foxp3-eGFP供體小鼠脾臟和淋巴結中的CD4 T細胞純化出來,分別球后注射入對照和突變小鼠。過繼轉移6周后,取受體鼠血樣和脾臟淋巴結細胞進行流式分析,檢測T細胞和調節(jié)T細胞的比例和變化情況。結果1.得到CD4 T細胞缺失的突變家系:在G3代小鼠血液樣品中,CD4 T細胞完全缺失,而其它淋巴細胞的比例分布正常。將有表型突變小鼠與野生小鼠雜交得到CD4 T細胞比例正常的子代,且G3子代符合孟德爾遺傳定律,此突變?yōu)槌Ｈ旧w的性遺傳。2.通過外顯子捕獲和下一代基因測序技術,確認導致CD4 T細胞完全缺失是位于6號染色體上的Cd4基因124873055位T→A的點突變,導致編碼區(qū)第99位氨基酸發(fā)生由異亮氨酸到天冬酰胺的錯義突變。3.此CD4缺失突變模型使Cd4完全喪失了在T細胞發(fā)育中的作用,造成CD4 T淋巴細胞完全缺失。4.CD4第99位氨基酸由異亮氨酸到天冬酰胺的突變不影響CD4蛋白在細胞表面的表達。5.C57BL/6J背景下,ENU誘變得到CD4T細胞缺失的小鼠可作為包括過繼轉移實驗在內研究CD4 T細胞的理想模式動物。結論ENU誘變導致C57BL/6J品系小鼠6號染色體Cd4基因124873055位堿基發(fā)生T→A的點突變,致使CD4第99位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘於０?得到CD4輔助T細胞完全缺失的小鼠模型,此突變小鼠可作為過繼轉移實驗研究CD4 T細胞的最佳模型。
【圖文】：

圖 1 ENU 誘變家系構建示意圖型分析、留取鼠尾：對 8 周齡的 G3 代小鼠打耳標標記，從眼.5ml 抗凝靜脈管中，上下顛倒混勻，標記耳標號。同時 1.5ml EP 管中，標記后置-20℃短暫保存以備提取 DNA箱；：將要標記的抗體按照稀釋倍數(shù)混合為 mix，每個流式血樣輕微離心至管底，渦旋震蕩混勻，即刻取 30μl 樣品冰上避光孵育 30min；理：將 FACS lysing solution 與蒸餾水按照 1:9 的比例配樣品中加入 400μl，渦旋震蕩，室溫避光裂解 10min；：將處理好的樣品渦旋振蕩，用 BD FACS Canto 上樣因定位

圖 2 轉染試劑示意圖表 3 轉染試劑及質粒配比XA MIXB2 3 1 125μl 0 Opti-MEM: 125μl 15μl 0 DNA(2500ng): 2.9μl 2P300: 5μl mixB 加入到 mixA 中，室溫靜置孵育 15-20min入到對應細胞培養(yǎng)孔中；養(yǎng)基，加入新鮮 DMEM 培養(yǎng)基各 1.8ml；熒光顯微鏡查看轉染情況并流式分析。集到 1.5ml 離心管中，，標記；min，吸棄上清；
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：2574227