發(fā)布時間：2020-01-24 16:51

【摘要】：目的克隆、表達惡性瘧原蟲紅細胞表面膜蛋白1 DBα(PfEMP1-DBLα)及其3個分段區(qū)域編碼基因,篩選出PfEMP1-DBα區(qū)與紅細胞表面受體-肝素/硫化肝素親和力最強的序列。方法根據大腸埃希菌密碼子組成特點,重新優(yōu)化并合成惡性瘧原蟲FCR3S1.2株PfEMP1-DBLα1245基因序列,采用PCR方法,將優(yōu)化后的基因序列分DBLαA、DBLαB和DBLαC等3段擴增。分別將全長基因和3個片段基因亞克隆至PGEX-4T-1載體,轉化至大腸埃希菌BL21(DE3),異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達。用谷胱甘肽-S-轉移酶標簽親和層析法純化表達產物。通過重組蛋白與肝素的親和試驗及糖胺聚糖(GAG)抑制試驗,分析功能區(qū)與肝素的親和力情況。結果含重組質粒的4個表達菌株(BL21-GEX-DBLα1245、BL21-GEX-DBLαA、BL21-GEX-DBLαB和BL21GEX-DBLαC)經IPTG誘導,獲得以可溶形式存在的重組蛋白,相對分子質量(M_r 73 600、M_r 41 600、M_r 42500和M_r 41 500)與預測的融合蛋白大小相符。重組蛋白與肝素的親和試驗及GAG抑制試驗結果表明,在PfEMP1-DBLα分段表達的3個功能區(qū)中,DBLα1245、DBLαA(1～142 aa)、DBLαB(143～284 aa)和DBLαC(285～415 aa)等4個重組蛋白均可與肝素結合,陰性對照GST不與肝素結合,其中DBLαC對肝素的親和力最強。結論 PfEMP1-DBLα區(qū)與肝素/硫化肝素親和力最強的序列為Q_(285)～Y_(415)(即DBLαC),該段序列在惡性瘧原蟲感染的紅細胞與周圍紅細胞的黏附過程中起關鍵作用。

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