【摘要】：干細(xì)胞是一類具有自我更新能力的多潛能干細(xì)胞。在一定條件下,它可以分化成多種不同組織及器官的細(xì)胞。干細(xì)胞存在于發(fā)育的不同時(shí)期,所表現(xiàn)的干細(xì)胞特點(diǎn),如自我更新及分化能力在各個(gè)時(shí)期都有所不同。隨著年齡的增長,干細(xì)胞的潛能有所減少。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能,干細(xì)胞可以分為全能干細(xì)胞)(Totipotent stem cells)、多能干細(xì)胞(Pluripotent stem cells)、專能干細(xì)胞(Multipotent stem cells)及單能干細(xì)胞(Unipotent stem cells)。全能干細(xì)胞是指受精卵到卵裂期32個(gè)細(xì)胞前的所有細(xì)胞,具有無限分化潛能,能夠分化成人體中各個(gè)組織器官的細(xì)胞,并可以發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體。多能干細(xì)胞是一類具有自我更新及自我復(fù)制能力的細(xì)胞,可以向幾乎人體所有類型的細(xì)胞分化,但不具有形成完整個(gè)體的潛能。專能干細(xì)胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化,如造血干細(xì)胞可以向紅細(xì)胞和白細(xì)胞等各類血細(xì)胞分化。而單能干細(xì)胞只能分化成一種細(xì)胞類型。根據(jù)干細(xì)胞來源,干細(xì)胞可分為人胚胎干細(xì)胞(Human embryonic stem cells,hESCs)、人成體干細(xì)胞(Human adult stem cells,hASCs)及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)。hESCs來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán),是一種未分化的細(xì)胞,受Oct4-Sox2-Nanog轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,具有在體外培養(yǎng)條件下,無限增殖、自我更新及多向分化的特點(diǎn)及發(fā)育的全能性,是一種多能干細(xì)胞。hESCs細(xì)胞形態(tài)體積小、核質(zhì)比高、在顯微鏡下可見一個(gè)或多個(gè)核仁,具有穩(wěn)定的二倍體核型、增殖迅速并表達(dá)多種相關(guān)抗原:Oct4、Nanog、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM-2、hTERT、TDGF-1、REX1、UTF-1、Ssea-3、Ssea-4、CD9、CD24和CD133。hESCs在體外及體內(nèi)均可被誘導(dǎo)分化為人機(jī)體中來源于外胚層、中胚層及內(nèi)胚層的所有細(xì)胞類型,但不能獨(dú)自發(fā)育成一個(gè)個(gè)體。ASCs為組織特異性干細(xì)胞,存在于人體相應(yīng)的各個(gè)組織中。ASCs在胎兒時(shí)期出現(xiàn),并貫穿整個(gè)生命。出生后在機(jī)體組織中含量較少、自我更新的能力有限,可以向同一個(gè)組織的不同細(xì)胞分化,是專能干細(xì)胞,主要功能為維持機(jī)體自身機(jī)能,為修復(fù)或替換受損組織提供細(xì)胞來源(如血液及皮膚等)。ASCs表達(dá)多種相關(guān)抗原:CD90、CD105、CD9、CD61、CD29、CD104、CD44、CD106、CD56、和CD166。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),是發(fā)現(xiàn)于骨髓的非造血干細(xì)胞。在正常實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下,間充質(zhì)干細(xì)胞可貼壁并在顯微鏡下呈紡錘樣生長,因此,它們是屬于ASCs一類的多能干細(xì)胞。目前,MSCs已從多種組織中分離,獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞、Wharton's jelly源間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、羊水膜及羊水間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞及其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(如皮膚和骨骼肌)。有研究表明MSCs可以從分化一種類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成分化另一種類型的細(xì)胞,即“干細(xì)胞橫向分化”。例如,Razavi S et al成功轉(zhuǎn)化人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的類Schwann細(xì)胞;Krause DS et al研究證明人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為肝、肺、胃腸道及皮膚上皮細(xì)胞。因此,間充質(zhì)干細(xì)胞具有多潛能性,可以誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。iPSCs的概念由日本科學(xué)家Yamanaka S et al.在2006年首次提出,使用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),通過病毒載體將外源4個(gè)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4的組合轉(zhuǎn)入終末分化的人體細(xì)胞中,重編程體細(xì)胞后獲得在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、干細(xì)胞標(biāo)志物、DNA甲基化及基因表達(dá)譜等方面與hESCs相似的細(xì)胞,并具有無限增殖、多向分化的潛能。上述干細(xì)胞都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn):hESCs在實(shí)驗(yàn)室條件下可長期培養(yǎng)并維持自我更新的能力及多潛能性,但其來源有限、具有形成畸胎瘤的潛在能力,以及其臨床使用受到倫理限制;hASCs來源廣泛,但其增殖能力及分化潛能有限,因此對(duì)組織修復(fù)能力有限;iPSCs具有多潛能性,來源廣泛,但由于腫瘤中也表達(dá)部分轉(zhuǎn)染所用轉(zhuǎn)錄因子,使iPSCs具備至腫瘤形成及病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道表明,在其他輔助條件下通過縮減所用的轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量也可形成iPSCs。此外,iPSCs轉(zhuǎn)化率較低,由最初代轉(zhuǎn)化成功率0.01-0.1%到目前的10%左右,有待進(jìn)一步提高。干細(xì)胞被用來治療多種疾病。其中,造血干細(xì)胞移植被人們熟知。外周血造血干細(xì)胞移植、臍血造血干細(xì)胞移植用來治療血液系統(tǒng)疾病,如急性白血病、再生障礙性貧血等獲得較好療效。日本學(xué)者在臨床上使用自體人iPSC來源視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞治療黃斑部退化,成為使用iPSCs應(yīng)用于臨床治療的第一例,并獲得有效成果,患者表明治療后,感覺視覺“變亮了”。此后自體或他人來源iPSCs在日本被多次應(yīng)用于臨床治療退行性疾病。有報(bào)道將hESCs分化形成的終末神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)用于退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如帕金森,Huntington病及阿爾茲海默病的治療,患者病情有所好轉(zhuǎn)。也有hESCs誘導(dǎo)分化形成的胰島細(xì)胞應(yīng)用于1型糖尿病的治療、以及分化形成心肌細(xì)胞用于修復(fù)壞死的心肌的案例。1型糖尿病是以胰島素絕對(duì)缺乏以及高血糖為特點(diǎn)的全身代謝性疾病。長期碳水化合物、脂肪及蛋白等代謝紊亂引起多器官或系統(tǒng)功能障礙,如眼、腎、神經(jīng)、心臟及血管等慢性病理性改變。臨床上,多數(shù)1型糖尿病患者通過注射外源胰島素及均勻攝入碳水化合物來維持血糖,但由于血糖的調(diào)控是個(gè)非常精密的過程,所以單純胰島素注射很難使血糖維持在生理性波動(dòng)區(qū)域范圍內(nèi)。此外,外源胰島素注射并不能有效預(yù)防糖尿病相關(guān)大血管及微血管并發(fā)癥。目前為止,臨床上唯一可治愈1型糖尿病的方法為胰島β-細(xì)胞的替代治療,包括胰腺移植及人胰島移植,但此方法供體來源有限、手術(shù)并發(fā)癥及終生使用免疫抑制劑等因素制約其發(fā)展。其他暫處于研究階段的胰島β-細(xì)胞的替代治方法包括異種胰島細(xì)胞、基因工程胰島素分泌細(xì)胞及干細(xì)胞。然而,現(xiàn)有的干細(xì)胞都存在不足,不能滿足臨床級(jí)治療用干細(xì)胞的條件。本課題組一直從事干細(xì)胞相關(guān)研究,先后從不同胎齡及組織中提取了不同類型的干細(xì)胞。且這幾類細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性。本研究中,我們從胎齡8-12周自然流產(chǎn)胎兒的關(guān)節(jié)軟骨中獲取了一類多能干細(xì)胞,命名為人軟骨來源多能干細(xì)胞。通過外科手術(shù)方法及胰蛋白酶和II型膠原酶二步消化法分離了人軟骨來源多能干細(xì)胞,使用H-DMEM及knock-out DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代和繼代細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)第3代細(xì)胞及第10代細(xì)胞的增殖能力沒有明顯改變,流式細(xì)胞儀分析結(jié)果提示,這是一群處于靜止期(G0/G1細(xì)胞周期)的原始細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn),將第3代細(xì)胞以1:5傳代后第12天左右到底7代時(shí),我們獲取了約200億個(gè)細(xì)胞,提示此細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖能力,為干細(xì)胞大量擴(kuò)增提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí),我們通過流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞既表達(dá)部分人胚胎多能干細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志(OCT4、NANOG、Sox2、Ssea-3和Ssea-4),同時(shí)也表達(dá)部分成人干細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志(CD29、CD44、CD90、CD105、CD73 和 STRO-1),且不表達(dá)移植物抗宿主相關(guān)抗原(CD80,CD40及HLA-DR),提示此類干細(xì)胞的生物學(xué)特性介于胚胎干細(xì)胞和成人干細(xì)胞并具有低免疫原性。通過RT-PCR檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)此類干細(xì)胞表達(dá)hESC相關(guān)基因:OCT4、NANOG、TDGF-1及中胚層相關(guān)基因TBX5,但不表達(dá)hESC相關(guān)基因hTERT;或其他胚層相關(guān)基因(MEF2C、SOX17、NEUROD及PAX6)。通過向三胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化,我們發(fā)現(xiàn)在不同誘導(dǎo)條件下,此細(xì)胞可以向中胚層的類脂肪細(xì)胞、類成骨細(xì)胞及類軟骨細(xì)胞分化;向外胚層的類神經(jīng)細(xì)胞分化;以及向內(nèi)胚層的胰島素分泌細(xì)胞分化,提示它為可以向三胚層細(xì)胞分化的多能干細(xì)胞,其分化潛能類似于人胚胎干細(xì)胞。綜上所述,我們從8-12周胎齡的胎兒關(guān)節(jié)軟骨中獲取了一類多能干細(xì)胞,此類細(xì)胞未見文獻(xiàn)報(bào)道,命名為人軟骨來源多能干細(xì)胞,它是較為原始的細(xì)胞,具有向三胚層細(xì)胞分化的潛能,并可在實(shí)驗(yàn)室條件下大量擴(kuò)增的特點(diǎn),為干細(xì)胞治療提供了一種新的臨床級(jí)治療用干細(xì)胞的可能及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;In vitro derivation of functional insulin-producing cells from human embryonic stem cells[J];Cell Research;2007年04期

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本文編號(hào)：2563902