【摘要】：一目的:本研究通過體內(nèi)實驗,旨在探討金黃地鼠皮脂腺及血清性激素在痤瘡發(fā)生機制中的作用,研究痤瘡合劑對金黃地鼠皮脂腺重疊葉數(shù)、皮脂腺斑面積大小及血清睪酮、雌二醇的影響,對痤瘡合劑治療尋常痤瘡的機理進行初步探索,為臨床應用提供實驗依據(jù)。材料與方法:采用金黃地鼠腹部皮脂腺斑作為研究對象,痤瘡合劑為干預因素,清熱暗瘡膠囊為陽性對照藥,以金黃地鼠腹部皮脂腺斑、血清睪酮、雌二醇水平為效應指標進行體內(nèi)試驗。將金黃地鼠隨機分為模型對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、清熱暗瘡膠囊組,模型對照組以2ml生理鹽水灌胃,中藥高中低劑量組以不同比例濃縮的痤瘡合劑2ml灌胃,清熱暗瘡膠囊組予稀釋的清熱暗瘡膠囊2ml灌胃,每日一次,于實驗第14天取材,用摘除眼球法采血3-5ml,采血后脫頸椎處死動物,在強光照射下,用游標卡尺分別測量左右側斑塊的最大橫徑和最大縱徑,然后立即取下金黃地鼠側腹部皮脂腺斑組織,固定并染色,于顯微鏡下觀察皮脂腺斑的重疊葉數(shù),ELISA法檢測血清中睪酮、雌二醇水平。結果:1.皮脂腺顯微結構下重疊葉數(shù):與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組、清熱暗瘡膠囊組皮脂腺重疊葉數(shù)顯著減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥高、中、低劑量組的皮脂腺重疊葉數(shù)無明顯差異(P0.05)。2.皮脂腺斑面積大小:用藥前各組皮脂腺斑大小無顯著性差異(P0.05)。用藥后,與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組兩側皮脂腺斑面積明顯減小,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組顯著增大,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05、P0.01),而中藥高劑量組與其相比顯著減小,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.睪酮水平:與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組、清熱暗瘡膠囊組睪酮水平顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的睪酮水平上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥高劑量組與其相比顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.雌二醇水平:與模型對照組比較,中藥高、中劑量組、清熱暗瘡膠囊組雌二醇水平顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),中藥低劑量組雌二醇上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的雌二醇水平下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),中藥高劑量組與其相比顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.痤瘡合劑通過抑制皮脂腺細胞的增生和分泌功能,進而使皮脂腺斑縮小,從而達到治療痤瘡的作用。2.痤瘡合劑通過降低金黃地鼠血清中的睪酮水平,增加雌二醇水平,進而使皮脂腺分泌、增生功能減退。3.痤瘡合劑抑制皮脂腺增生和分泌的功能隨著給藥劑量的增加逐漸加強,呈良好的量效關系。二目的:研究以兔耳痤瘡模型為研究對象,以ERK、NF-κB、p38MAPK、AhR/ARNT信號通路調(diào)控為研究中心,利用現(xiàn)代生物學實驗技術,分別測定ERK、NF-κB、p38MAPK信號通路及其調(diào)控下的TNF-α、IL-6、IL-8蛋白表達水平,Ah R/ARNT及其直接調(diào)控下的CYP1A1、GSTA1蛋白表達水平,探索在痤瘡發(fā)病過程中相關信號通路在其中的作用,從而全面探討并揭示痤瘡合劑在調(diào)控ERK、NF-κB、p38MAPK、Ah R/ARNT信號通路的多個環(huán)節(jié)中的作用機制,為中藥安全有效治療痤瘡提供實驗依據(jù),為后期臨床研究奠定理論基礎。材料與方法:采用外涂煤焦油的方法建立兔耳痤瘡模型,分別在家兔雙耳內(nèi)側面耳管開口處2cm×2cm范圍,每日用玻璃棒涂煤焦油1次,每次約0.5ml,連續(xù)2周。造模第14天取耳部痤瘡病變皮膚活檢,用10%的甲醛固定然后進行石蠟蠟塊包埋再切片,每個標本需要連續(xù)切片4張并以HE染色,然后切片并烘干,其后在顯微鏡下觀察,確定造模成功后,進行后續(xù)實驗。痤瘡合劑為干預因素,清熱暗瘡膠囊為陽性對照藥物,以p38MAPK、NF-κB、Ah R/ARNT信號傳導通路中相關蛋白表達為效應指標進行體內(nèi)實驗。將48只家兔隨機分成6組,即空白對照組、模型對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、清熱暗瘡膠囊組,模型對照組予20ml生理鹽水灌胃,中藥高中低劑量組以不同比例濃縮的痤瘡合劑20ml灌胃,清熱暗瘡膠囊組予稀釋的清熱暗瘡膠囊20ml灌胃,每日一次,連續(xù)治療14天后全部處死,取耳部皮膚組織觀察以下指標:免疫組化法檢測TNFR1、TNF-α、IL-6、IL-8、ERK、NF-κB、p38MAPK蛋白表達,Western blot法檢測Ah R、CYP1A1、GSTA1蛋白表達。結果:1.造模14天后肉眼可見兔耳表面粗糙、增厚、有粉刺樣皮損;組織病理改變可見角化過度,表皮及毛囊上皮的顆粒層、棘層仍增生明顯,毛囊口及漏斗部仍見角化物質堆積,漏斗部擴大如壺狀,真皮內(nèi)仍見較多的炎性細胞浸潤。2.免疫組化法檢測結果:2.1 TNFR1蛋白表達檢測結果:空白對照組TNFR1蛋白的平均光密度值為陰性,模型對照組TNFR1蛋白的平均光密度值表達為強陽性。免疫組化平均光密度值測定結果:與空白對照組比較,模型對照組TNFR1平均光密度值顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組TNFR1平均光密度值顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的TNFR1平均光密度值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05、P0.01),而中藥高劑量組TNFR1平均光密度值則降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。2.2 TNF-α蛋白表達檢測結果:空白對照組TNF-α蛋白的平均光密度值為陰性,模型對照組TNF-α蛋白的平均光密度值表達為強陽性。免疫組化平均光密度值測定結果:與空白對照組比較,模型對照組TNF-α平均光密度值顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中劑量組TNF-α平均光密度值顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),中藥低劑量組TNF-α平均光密度值顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的TNF-α平均光密度值上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥高劑量組與清熱暗瘡膠囊組相比差異無統(tǒng)計學意義。2.3 IL-6蛋白表達檢測結果:空白對照組IL-6蛋白的平均光密度值為陰性,模型對照組IL-6蛋白的平均光密度值表達為強陽性。免疫組化平均光密度值測定結果:與空白對照組比較,模型對照組IL-6平均光密度值顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組IL-6平均光密度值顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的IL-6平均光密度值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥高劑量組IL-6平均光密度值則降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.4 IL-8蛋白表達檢測結果:空白對照組IL-8蛋白的平均光密度值為陰性,模型對照組IL-8蛋白的平均光密度值表達為強陽性。免疫組化平均光密度值測定結果:與空白對照組比較,模型對照組IL-8平均光密度值顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組IL-8平均光密度值顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的IL-8平均光密度值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05、P0.01),而中藥高劑量組與清熱暗瘡膠囊組相比則明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.5 ERK蛋白表達檢測結果:空白對照組ERK蛋白的平均光密度值為陰性,模型對照組ERK蛋白的平均光密度值表達為強陽性。免疫組化平均光密度值測定結果:與空白對照組比較,模型對照組ERK平均光密度值顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中劑量組ERK平均光密度值顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥低劑量組與其相比不具有統(tǒng)計學意義;與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的ERK平均光密度值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥高劑量組ERK平均光密度值則降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.6 NF-κB蛋白表達檢測結果:空白對照組NF-κB蛋白的平均光密度值為陰性,模型對照組NFκB蛋白的平均光密度值表達為強陽性。免疫組化平均光密度值測定結果:與空白對照組比較,模型對照組NF-κB平均光密度值顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中劑量組NFκB平均光密度值顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),中藥低劑量組NF-κB水平平均光密度值降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的NF-κB平均光密度值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥高劑量組NF-κB平均光密度值則降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.7 p38MAPK蛋白表達檢測結果:空白對照組p38MAPK蛋白的平均光密度值為陰性,模型對照組p38MAPK蛋白的平均光密度值表達為強陽性。免疫組化平均光密度值測定結果:與空白對照組比較,模型對照組p38MAPK平均光密度值顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組p38MAPK平均光密度值顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥低劑量組的p38MAPK平均光密度值增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),中藥中劑量組與其相比差異不具有統(tǒng)計學意義,中藥高劑量組p38MAPK平均光密度值與其相比顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.Western blot法檢測結果:3.1 Ah R蛋白水平:與空白對照組比較,模型對照組Ah R水平顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組Ah R表達水平顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的Ah R的表達水平上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥高劑量組Ah R表達水平則下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.2 CYP1A1蛋白水平:與空白對照組比較,模型對照組CYP1A1水平顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組CYP1A1表達水平顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與清熱暗瘡膠囊組比較,中藥中、低劑量組的CYP1A1表達水平上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而中藥高劑量組與清熱暗瘡膠囊組相比CYP1A1顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.3 GSTA1蛋白水平:與空白對照組比較,模型對照組GSTA1水平顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型對照組比較,中藥高、中、低劑量組GSTA1表達水平顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);中藥中、低劑量組GSTA1表達水平顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05、P0.01),而中藥高劑量組與清熱暗瘡膠囊組比較GSTA1表達水平顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.痤瘡合劑能下調(diào)血清TNF-α、IL-8、IL-6炎癥因子蛋白水平表達,抑制痤瘡炎癥發(fā)展。2.痤瘡合劑能下調(diào)p38MAPK、ERK及NF-κB蛋白表達水平,干擾信號p38MAPK、ERK及NF-κB信號通路。3.血清炎癥因子受p38MAPK、ERK及NF-κB信號通路的調(diào)控,痤瘡合劑治療痤瘡的途徑之一是通過降低炎癥因子水平,抑制p38MAPK、ERK及NF-κB信號通路。4.痤瘡合劑可以干擾AhR/ARNT信號通路及其直接調(diào)控下的CYP1A1、GSTA1水平,調(diào)節(jié)內(nèi)分泌水平,干擾痤瘡的發(fā)展進程。5.痤瘡合劑下調(diào)血清炎癥因子、調(diào)控p38MAPK、ERK、NF-κB及Ah R/ARNT信號通路的功能隨著給藥劑量的增加逐漸加強,呈良好的量效關系。
【圖文】：

2各組金黃地鼠用藥前后皮脂腺斑面積比較

模型對照組病理學觀察（HE染色,×40）
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5;R-332

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本文編號：2558043