【摘要】：白念珠菌是人體的一種共生菌,在一定條件下可以轉變?yōu)橐环N致病菌,臨床調查表明白念珠菌已經成為全球一種普遍流行的致病真菌。白念珠菌主要通過感染人體內部臟腑以及血液致病。通過對白念珠菌相關文獻的查閱我們發(fā)現(xiàn)白念珠菌的致病性以及耐藥強度在逐年增強,其中熱休克蛋白90參與的白念珠菌pck1通路在提高白念珠菌的生長速度以及增強對唑類等抗菌藥物的耐藥性方面有重要意義[1]。HSP90的輔助功能與其蛋白結構密切相關,尤其是N端和C端的部分關鍵氨基酸位點對真菌HSP90的功能有重要作用[2]。我們通過蛋白質軟件分析發(fā)現(xiàn),白念珠菌HSP90與人源HSP90堿基序列同源性接近65%,而C端的差異性較大。這個發(fā)現(xiàn)為研發(fā)白念珠菌HSP90較高特異性抑制劑靶點提供了一定的理論依據(jù)�；趦烧咝蛄胁町惖南嚓P文獻以及軟件以及計算機軟件分析結果發(fā)現(xiàn)白念珠菌中CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655)對于CaHSP90的二聚體形成可能會產生一定的影響,而其相對應人源HSP90部分為hHSP90(1-679)和hHSP90(1-696),根據(jù)上述的認識我們發(fā)現(xiàn),通過研究白念珠菌HSP90與人體HSP90結構差異去發(fā)現(xiàn)CaHSP90的特異性較高的耐藥靶點,從而提高白念珠菌的藥物敏感性。前期我們成功完成了體外質粒的構建,初期主要是通過酶切技術將SC5314實驗室標準菌株的CaHSP90,CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655)的基因序列裝入PET22b質粒中,中期我們通過在大腸桿菌胞內表達,用His-鎳柱蛋白純化技術純化了CaHSP90以及CaHSP90(1-673),CaHSP90(1-655),hHSP90以及hHSP90(1-679),hHSP90(1-696)這些蛋白,后期我們用Superdex200蛋白制備分析柱等技術對CaHSP90,CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655),HSP90以及hHSP90(1-679),hHSP90(1-696)這些蛋白進行了質量計算和蛋白結構功能的分析。我們還研究了CaHSP90的蛋白質結構變化對于化學修飾的影響,最后我們進行了HSP90,CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655)的ATPase活性檢測實驗。結果:通過PCR技術和生物公司的測序證明我們在體外成功構建了相關質粒,蛋白電泳結果顯示復制的質粒能夠在大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中成功表達。通過Superdex200制備柱我們發(fā)現(xiàn)CaHSP90(1-655)與hHSP90(1-679)存在結構差異,CaHSP90(1-655)是在單體與二體之間,hHSP90是二體。CaHSP90,CaHSP90(1-673),hHSP90以及hHSP90(1-696)都形成了寡聚,寡聚的形成與溫度以及C端結構的變化有關,內在具體機制仍待研究。
【圖文】：

圖 2 載體質粒結構圖注.目的基因主要插入在黑色條帶中的Nde1和Xho1如圖所示，該質�？偣矠�5493bp該質粒為氨芐抗性，并標有 his—tag 標簽。1.CaHSP90，CaHSP90（1-673），CaHSP90（1-655）基因 PCR電泳結果如下圖所示 PCR 結果顯示 1 號泳道 CaHSP90 為 2124bp，2 號泳道 CaHSP90（1-673）為 2019bp，3 號泳道為空白，4 號泳道 CaHSP90（1-655）為 1965bp，可以看出三條目的基因條帶都較清晰，，特異較高

圖 3 PCR 電泳結果圖圖 3 1 泳道:CaHSP90，2 泳道：CaHSP90（1-673），3 泳道：空白，4 泳aHSP90（1-655）. CaHSP90, CaHSP90（1-673），CaHSP90（1-655）菌液 PCR 結如下圖我們主要是根據(jù)菌液 PCR 鑒定我們所要研究的目的基因 1 號和 4 號
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R379.4


本文編號：2553301