【摘要】：志賀菌(Shigella spp.)是一類引起細菌性痢疾的重要腸道致病菌,每年感染人數(shù)接近1.67億,其中有100萬病例因此病導致死亡,而且大部分的感染病例為5歲以下的兒童。這一病原菌主要流行于發(fā)展中國家,引起流行的主要因素是當?shù)剌^差的衛(wèi)生環(huán)境、以及高昂的抗生素費用。在19世紀40年代,志賀菌就已經(jīng)被區(qū)分為4個不同的亞群,而且每個不同的亞群根據(jù)其O抗原結(jié)構(gòu)的不同又能夠被區(qū)分為不同的亞型:痢疾志賀菌(17個亞型),福氏志賀菌(16個血清型),鮑氏志賀菌(18個亞型)和宋內(nèi)志賀菌(1個亞型)。而且志賀菌在其發(fā)現(xiàn)之初就認為與大腸桿菌進化親緣關(guān)系較近,而且近年來越來越多分子水平的證據(jù)也支持這一觀點,甚至有分析指出志賀菌應該歸為大腸桿菌的一個致病變種。成簇規(guī)律的短回文重復序列(CRISPR)結(jié)構(gòu)最早是在1987年于大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn),它的主要結(jié)構(gòu)是由長度為24-47bp的重復序列及其中穿插著的21-72bp的間隔序列組成的R-S單元,也被稱為一個CRISPR位點,間隔序列被認為主要來源于外界的基因元件,而且在不同的細菌中一般具有不同的間隔序列排列。與R-S單元相鄰的是前導序列和Cas蛋白基因序列,其產(chǎn)物在CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮功能的過程中發(fā)揮重要作用。在CRISPR系統(tǒng)的實際功能被發(fā)現(xiàn)之前,這一結(jié)構(gòu)就被用來對細菌進行分子分型,在結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌及鼠疫耶爾森氏菌中均開發(fā)了基于CRISPR結(jié)構(gòu)進行分型的方法。在被發(fā)現(xiàn)的20年之后,CRISPR結(jié)構(gòu)終于被證明在抵抗外界基因元件如質(zhì)粒或噬菌體的過程中發(fā)揮適應性的免疫功能。而且隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)其不僅僅具有免疫功能,在對細菌的代謝、毒力以及群體行為方面也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。本研究的目的是分析志賀菌這一重要的醫(yī)學病原菌中存在的CRISPR系統(tǒng)遺傳多態(tài)性,包括其CRISPR位點及其相鄰的CRISPR-Cas蛋白,并通過這些分析來了解志賀菌中的CRISPR結(jié)構(gòu)是否適合作為志賀菌快速檢測及分子分型的靶標,同時在對志賀菌中CRISPR的遺傳多態(tài)性進行充分了解的基礎(chǔ)上,對其免疫功能進行研究與驗證,并根據(jù)以上的研究結(jié)果探究志賀菌中的CRISPR系統(tǒng)是否存在對細菌的調(diào)控功能。為了分析志賀菌中CRISPR系統(tǒng)的遺傳多態(tài)性,本研究選取了237株不同型別的志賀菌以及13株大腸桿菌進行6個CRISPR位點的PCR擴增并測序,通過以上分析使我們對不同型別的志賀菌中CRISPR系統(tǒng)的遺傳多態(tài)性有了充分的了解,同時本研究也發(fā)現(xiàn)了志賀菌中crispr結(jié)構(gòu)特有的r-s結(jié)構(gòu)被替換的現(xiàn)象以及末端重復序列特殊的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu);志賀菌各個型別之間的crispr結(jié)構(gòu)均存在一定的差異性,而且這種差異性在相應的型別中是保守存在的,同時,也發(fā)現(xiàn)了志賀菌中特有的crispr-crf位點,基于以上結(jié)果建立了基于志賀菌crispr結(jié)構(gòu)的快速檢測與分子分型的新方法。在對志賀菌及大腸桿菌中的crispr位點多態(tài)性有了充分了解的基礎(chǔ)上,通過對兩個種群中的crispr結(jié)構(gòu)進行比較,發(fā)現(xiàn)志賀菌中的大部分crispr位點在大腸桿菌中同樣存在,這種共存性說明它們二者存在著較近的進化關(guān)系,為了進行更深入的研究,基于它們擁有的間隔序列的排列情況對各個型別的志賀菌及大腸桿菌進行了聚類分析,結(jié)果顯示不同型別的志賀菌與大腸桿菌間的進化距離是不同的,這說明了志賀菌的各個型別雖然在表型水平屬于趨同進化,但是其在基因組水平卻分屬于不同的自然族群。同時,在對與志賀菌存在相同crispr位點的菌種進行分析后發(fā)現(xiàn)了crispr系統(tǒng)在不同菌種間進行縱向遺傳與水平基因轉(zhuǎn)移的證據(jù)。這些結(jié)果說明,crispr系統(tǒng)可以作為對志賀菌及其它菌種進行進化分析的工具。本研究通過對志賀菌及大腸桿菌中的cas蛋白基因簇進行擴增及比較分析,發(fā)現(xiàn)志賀菌中的crispr系統(tǒng)在crispr的分類中屬于i-e型,而且在宋內(nèi)志賀菌的cas蛋白基因簇中分別插入了兩個插入序列is600和issfl2,為了研究宋內(nèi)志賀菌中的crispr是否具有正常的免疫功能,本研究采用了一種pstkst質(zhì)粒無痕敲除的方法對其中存在的兩段插入序列進行了無痕敲除,同時也對抑制crispr功能的hns基因進行了敲除,隨后構(gòu)建含有靶標序列的耐藥質(zhì)粒對野生株及突變株進行轉(zhuǎn)化實驗,結(jié)果顯示恢復了crispr完整結(jié)構(gòu)的突變株具有對含有靶標的質(zhì)粒的剪切作用,而具有插入序列的crispr系統(tǒng)并不具備剪切作用。這說明插入序列的存在影響了crispr系統(tǒng)正常免疫功能的發(fā)揮。這一結(jié)果首次確定了插入序列能夠沉默crispr系統(tǒng)的免疫功能。在對志賀菌crispr正常的免疫功能進行恢復的基礎(chǔ)上,我們對crispr系統(tǒng)的調(diào)控功能進行了探究。通過多態(tài)性分析中對間隔序列進行的同源性分析,顯示其間隔序列與其自身的染色體上的內(nèi)源性基因糖原磷酸化酶glgp基因存在一定的同源性,為了探究宋內(nèi)志賀菌crispr系統(tǒng)與其對自身基因的靶向之間存在的關(guān)系,我們首先對野生株和突變株中的crispr自身靶向的glgp基因的表達量進行了相對定量分析,顯示其表達量發(fā)生了下降。隨后從表型水平對突變株進行了分析,結(jié)果顯示恢復了crispr完整結(jié)構(gòu)的突變株△isd的生長速率發(fā)生了下降,而且取消了此突變株中hns基因的抑制作用后的突變株△isd-hns生長速率的下降更加明顯,同時我們也對各個突變株進行了生化指標分析,發(fā)現(xiàn)恢復了CRISPR完整結(jié)構(gòu)的突變株中與生長代謝相關(guān)的指標發(fā)生了下降。說明CRISPR系統(tǒng)在恢復其結(jié)構(gòu)之后,志賀菌很有可能通過對自身基因的靶向?qū)ζ渥陨淼纳L產(chǎn)生了一定的抑制作用,從而提示了CRISPR系統(tǒng)對細菌的調(diào)控方式。為了更進一步從蛋白水平對突變株中發(fā)生的變化進行分析,本研究利用了基于iTRAQ技術(shù)的比較蛋白組學研究對突變株中發(fā)生變化的蛋白進行了分析,結(jié)果顯示突變株△ISD中下調(diào)的蛋白種類要高于其它的突變株,而且對這些差異蛋白進行GO聚類分析及KEGG通路分析,顯示其中絕大多數(shù)與細菌的能量代謝相關(guān),說明CRISPR系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的恢復影響了宋內(nèi)志賀菌多種蛋白基因的表達,從蛋白水平確定了CRISPR系統(tǒng)與志賀菌代謝調(diào)控之間的相關(guān)性。綜上所述,本研究通過全面系統(tǒng)的分析,已經(jīng)對志賀菌中的CRISPR系統(tǒng)有了充分的了解,同時也確定了志賀菌中的CRISPR系統(tǒng)可以作為志賀菌快速檢測及分子分型的靶標;并在多態(tài)性分析的基礎(chǔ)上,對各個型別中的CRISPR位點進行聚類分析也確定志賀菌中的各個型別在基因組水平并不屬于真正的自然族群,也證明了CRISPR系統(tǒng)可以作為研究志賀菌、大腸桿菌以及其它細菌之間進化關(guān)系的工具;同時也通過對志賀菌中CRISPR完整結(jié)構(gòu)的恢復,驗證了其正常的免疫功能;對突變株的表型及比較蛋白組學的分析發(fā)現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)對志賀菌代謝調(diào)控作用的方式,也為進一步研究CRISPR系統(tǒng)對細菌的調(diào)控功能提供了研究的方向。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.25
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本文編號：2539069