【摘要】：立克次體是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏染色呈陰性的致病微生物,立克次體感染能夠引起立克次體病。立克次體病主要有:斑點(diǎn)熱、恙蟲病、斑疹傷寒等等。立克次體病是一類呈世界性分布的、嚴(yán)重威脅人類健康的人獸共患的自然疫源性疾病。其中斑點(diǎn)熱是由斑點(diǎn)熱群立克次體感染引起。主要的斑點(diǎn)熱包括立氏立克次體(R.rickettsii)引起的落磯山斑點(diǎn)熱(Rocky Mountain Spotted Fever,RMSF)、康氏立克次體(R.conorii)引起的地中海斑點(diǎn)熱(Mediterranean Spotted Fever,MSF)、澳大利亞立克次體(R.australis)引起的昆士蘭斑點(diǎn)熱(Queensland Spotted Fever,QSF)、小蛛立克次體(R.akari)引起的立克次體痘(Rickettsial Pox)等。斑點(diǎn)熱的潛伏期為4~7天,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉痛和皮疹等癥狀。其中立氏立克次體引起的落磯山斑點(diǎn)熱臨床癥狀最為嚴(yán)重,如果得不到及時(shí)治療,感染者大多會(huì)因?yàn)槟I功能衰竭而死亡。斑點(diǎn)熱在我國(guó)廣泛存在,主要有由西伯利亞立克次體(R.sibirica)引起的北亞熱(North Asian Tick-borne Rickettsiosis)和由黑龍江立克次體(R.heilongjiangensis)引起的遠(yuǎn)東斑點(diǎn)熱(Far East Spotted Fever)。黑龍江立克次體引起的遠(yuǎn)東斑點(diǎn)熱是東北亞洲地區(qū)的一種新發(fā)傳染病。感染者可有發(fā)熱、寒顫、頭痛、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、厭食、以及黃斑或斑丘疹等癥狀,合并有肝腫大和谷丙轉(zhuǎn)氨酶和/或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高等肝臟損傷表現(xiàn)。用黑龍江立克次體感染小鼠,小鼠會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的全身感染癥狀,并伴隨有肺、肝、脾、腦組織損傷。最初T細(xì)胞免疫球蛋白和粘附分子-3(Tim-3)被認(rèn)為是Th1細(xì)胞的特異性受體,它通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的功能,維持免疫平衡和免疫耐受。大量的研究表明,Tim-3也表達(dá)于天然免疫細(xì)胞,包括:單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)和自然殺傷細(xì)胞(NK)等,并且Tim-3通過(guò)選擇性的活化天然免疫細(xì)胞促進(jìn)免疫平衡。另外,有研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達(dá)于人類血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)。近些年,Tim-3在抗感染免疫方面的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。Tim-3信號(hào)通路可以在病毒、胞外菌、胞內(nèi)菌的感染中,發(fā)揮抗感染的免疫調(diào)節(jié)作用。但是,Tim-3在專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌——立克次體感染中的免疫學(xué)作用還不清楚。血管內(nèi)皮細(xì)胞是立克次體感染最主要的靶細(xì)胞。入侵宿主后,立克次體主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。在立克次體感染過(guò)程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活并釋放大量細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子在抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用。本課題從動(dòng)物水平、細(xì)胞水平和分子水平三個(gè)層面研究探討:tim-3是否參與立克次體感染早期過(guò)程;tim-3是增強(qiáng)或抑制機(jī)體抗立克次體免疫應(yīng)答;其作用機(jī)制是什么?首先,我們經(jīng)腹腔注射法用黑龍江立克次體感染小鼠,再分別用qpcr法和rt-pcr方法檢測(cè)感染1~3天內(nèi)小鼠脾臟的立克次體載量變化和tim-3mrna表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)立克次體感染3天內(nèi),小鼠脾臟立克次體數(shù)量隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加,tim-3mrna表達(dá)水平則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。用黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞系(ea.hy926),結(jié)果顯示感染后3天內(nèi),內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)量逐漸增多,內(nèi)皮細(xì)胞的tim-3mrna表達(dá)水平則逐漸下降。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,因此tim-3參與了立克次體感染早期機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程。tim-3參與了立克次體感染早期的免疫應(yīng)答,那么它在該過(guò)程中發(fā)揮怎樣的免疫調(diào)節(jié)作用呢?我們假設(shè)tim-3能夠促進(jìn)機(jī)體或者血管內(nèi)皮細(xì)胞清除/殺傷細(xì)胞內(nèi)立克次體。為了證明這一假說(shuō),我們使用小鼠tim-3胞外段與人igg1-fc融合蛋白(mtim-3-ig)阻斷小鼠的tim-3信號(hào)通路,并用人igg1-fc蛋白(ig)作為同型對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),tim-3信號(hào)通路阻斷后,小鼠脾臟的立克次體數(shù)量明顯增多,同時(shí)小鼠外周血中細(xì)胞因子(ifn-γ、tnf-α、il-2、il-18)和趨化因子rantes表達(dá)水平明顯降低。這一結(jié)果提示,tim-3信號(hào)通路的阻斷能夠抑制宿主/宿主細(xì)胞的抗胞內(nèi)寄生菌相關(guān)的免疫因素,進(jìn)而促進(jìn)立克次體感染。另外,用黑龍江立克次體感染tim-3高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠(tim-3-tg),我們發(fā)現(xiàn)立克次體感染后第3天,tim-3-tg小鼠無(wú)明顯感染癥狀,而野生型對(duì)照小鼠感染癥狀則非常明顯。并且,tim-3-tg小鼠外周血的抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠。該結(jié)果進(jìn)一步證明,增加tim-3表達(dá)能夠增強(qiáng)宿主抗立克次體免疫應(yīng)答。黑龍江立克次體感染重組人tim-3-人igg1-fc融合蛋白(htim-3-ig)預(yù)處理的人血管內(nèi)皮細(xì)胞(ea.hy926),結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染3天后該細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)量顯著多于對(duì)照組細(xì)胞。這一結(jié)果說(shuō)明,tim-3信號(hào)激活后能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷胞內(nèi)立克次體。用黑龍江立克次體感染穩(wěn)定高表達(dá)或低表達(dá)tim-3的ea.hy926細(xì)胞,立克次體感染3天后的結(jié)果顯示,tim-3高表達(dá)細(xì)胞的立克次體數(shù)量顯著低于對(duì)照細(xì)胞,而tim-3低表達(dá)細(xì)胞的立克次體數(shù)量顯著高于對(duì)照細(xì)胞。綜上所述,增加tim-3表達(dá)能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷胞內(nèi)立克次體的作用,而阻斷tim-3信號(hào)或者抑制tim-3表達(dá)會(huì)抑制相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)立克次體的增加。Tim-3在立克次體感染的過(guò)程中具有增強(qiáng)機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)。NO在殺傷胞內(nèi)菌方面發(fā)揮重要作用。我們用細(xì)胞因子(RANTES、TNF-α、IFN-γ和IL-1β)雞尾酒方法刺激人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),并用黑龍江立克次體感染該細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞因子雞尾酒處理的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO顯著增加,同時(shí)胞內(nèi)立克次體拷貝數(shù)減少,而受iNOS抑制劑NGMMLA作用的內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生減少,且細(xì)胞內(nèi)的立克次體數(shù)量增加。該研究明確證明,血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠通過(guò)增加NO的合成去殺傷胞內(nèi)立克次體。Tim-3能否通過(guò)增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO抑制立克次體感染?我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無(wú)論是阻斷Tim-3信號(hào)通路還是降低Tim-3表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,感染立克次體后,細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)水平明顯降低,并且IFN-γmRNA表達(dá)水平也同樣降低。這些數(shù)據(jù)提示,Tim-3信號(hào)通路的激活能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的iNOS表達(dá),并通過(guò)增加NO的合成去殺傷細(xì)胞內(nèi)的立克次體。我們還發(fā)現(xiàn),Tim-3-Tg小鼠感染3天后,脾臟細(xì)胞iNOS、IFN-γ和TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著高于野生型小鼠,而脾臟立克次體數(shù)量則顯著低于野生小鼠。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明,Tim-3信號(hào)通路的激活能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO合成,從而增強(qiáng)機(jī)體抑制立克次體感染。本課題證明,在黑龍江立克次體感染早期,Tim-3表達(dá)增強(qiáng)和Tim-3信號(hào)通路的激活,能夠上調(diào)機(jī)體和血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)立克次體的殺傷作用,并明確了NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷胞內(nèi)寄生立克次體的重要因素。本研究豐富了立克次體致病機(jī)制和抗立克次體免疫機(jī)制內(nèi)容,為立克次體病的診治提供了新的潛在靶標(biāo)。
【圖文】：

圖 1-1. pRNAi-U6.1/Neo 質(zhì) 圖譜細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，若細(xì)胞狀態(tài)良好，則向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入G418的篩選濃度為500 ng/ml。每3天給細(xì)胞換一次新的培養(yǎng)基（含500 ng/ml G418）。

并將其與pEGFP-N1/NeoR/KanR（圖譜見圖1-2.）連接，酶切位alⅠ，獲得重組Tim-3的質(zhì)粒。. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 步 驟 同 3.3 ，， 構(gòu) 建 成 穩(wěn) 定 高 表 達(dá) Tim-3 的 EA.hy 926 細(xì)verexpression）；空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（Vector）為同型對(duì)照。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2529355