【摘要】：立克次體是嚴格細胞內(nèi)寄生的革蘭氏染色呈陰性的致病微生物,立克次體感染能夠引起立克次體病。立克次體病主要有:斑點熱、恙蟲病、斑疹傷寒等等。立克次體病是一類呈世界性分布的、嚴重威脅人類健康的人獸共患的自然疫源性疾病。其中斑點熱是由斑點熱群立克次體感染引起。主要的斑點熱包括立氏立克次體(R.rickettsii)引起的落磯山斑點熱(Rocky Mountain Spotted Fever,RMSF)、康氏立克次體(R.conorii)引起的地中海斑點熱(Mediterranean Spotted Fever,MSF)、澳大利亞立克次體(R.australis)引起的昆士蘭斑點熱(Queensland Spotted Fever,QSF)、小蛛立克次體(R.akari)引起的立克次體痘(Rickettsial Pox)等。斑點熱的潛伏期為4~7天,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉痛和皮疹等癥狀。其中立氏立克次體引起的落磯山斑點熱臨床癥狀最為嚴重,如果得不到及時治療,感染者大多會因為腎功能衰竭而死亡。斑點熱在我國廣泛存在,主要有由西伯利亞立克次體(R.sibirica)引起的北亞熱(North Asian Tick-borne Rickettsiosis)和由黑龍江立克次體(R.heilongjiangensis)引起的遠東斑點熱(Far East Spotted Fever)。黑龍江立克次體引起的遠東斑點熱是東北亞洲地區(qū)的一種新發(fā)傳染病。感染者可有發(fā)熱、寒顫、頭痛、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、厭食、以及黃斑或斑丘疹等癥狀,合并有肝腫大和谷丙轉(zhuǎn)氨酶和/或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高等肝臟損傷表現(xiàn)。用黑龍江立克次體感染小鼠,小鼠會表現(xiàn)出嚴重的全身感染癥狀,并伴隨有肺、肝、脾、腦組織損傷。最初T細胞免疫球蛋白和粘附分子-3(Tim-3)被認為是Th1細胞的特異性受體,它通過調(diào)節(jié)Th1細胞的功能,維持免疫平衡和免疫耐受。大量的研究表明,Tim-3也表達于天然免疫細胞,包括:單核/巨噬細胞、樹突狀細胞(DCs)和自然殺傷細胞(NK)等,并且Tim-3通過選擇性的活化天然免疫細胞促進免疫平衡。另外,有研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達于人類血管內(nèi)皮細胞(ECs)。近些年,Tim-3在抗感染免疫方面的研究受到越來越多的關(guān)注。Tim-3信號通路可以在病毒、胞外菌、胞內(nèi)菌的感染中,發(fā)揮抗感染的免疫調(diào)節(jié)作用。但是,Tim-3在專性細胞內(nèi)寄生菌——立克次體感染中的免疫學作用還不清楚。血管內(nèi)皮細胞是立克次體感染最主要的靶細胞。入侵宿主后,立克次體主要在血管內(nèi)皮細胞生長和繁殖。在立克次體感染過程中,血管內(nèi)皮細胞被激活并釋放大量細胞因子,這些細胞因子在抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用。本課題從動物水平、細胞水平和分子水平三個層面研究探討:tim-3是否參與立克次體感染早期過程;tim-3是增強或抑制機體抗立克次體免疫應(yīng)答;其作用機制是什么?首先,我們經(jīng)腹腔注射法用黑龍江立克次體感染小鼠,再分別用qpcr法和rt-pcr方法檢測感染1~3天內(nèi)小鼠脾臟的立克次體載量變化和tim-3mrna表達量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)立克次體感染3天內(nèi),小鼠脾臟立克次體數(shù)量隨著感染時間延長而逐漸增加,tim-3mrna表達水平則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。用黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞系(ea.hy926),結(jié)果顯示感染后3天內(nèi),內(nèi)皮細胞內(nèi)立克次體數(shù)量逐漸增多,內(nèi)皮細胞的tim-3mrna表達水平則逐漸下降。體內(nèi)、外實驗結(jié)果一致,因此tim-3參與了立克次體感染早期機體的免疫應(yīng)答過程。tim-3參與了立克次體感染早期的免疫應(yīng)答,那么它在該過程中發(fā)揮怎樣的免疫調(diào)節(jié)作用呢?我們假設(shè)tim-3能夠促進機體或者血管內(nèi)皮細胞清除/殺傷細胞內(nèi)立克次體。為了證明這一假說,我們使用小鼠tim-3胞外段與人igg1-fc融合蛋白(mtim-3-ig)阻斷小鼠的tim-3信號通路,并用人igg1-fc蛋白(ig)作為同型對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),tim-3信號通路阻斷后,小鼠脾臟的立克次體數(shù)量明顯增多,同時小鼠外周血中細胞因子(ifn-γ、tnf-α、il-2、il-18)和趨化因子rantes表達水平明顯降低。這一結(jié)果提示,tim-3信號通路的阻斷能夠抑制宿主/宿主細胞的抗胞內(nèi)寄生菌相關(guān)的免疫因素,進而促進立克次體感染。另外,用黑龍江立克次體感染tim-3高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠(tim-3-tg),我們發(fā)現(xiàn)立克次體感染后第3天,tim-3-tg小鼠無明顯感染癥狀,而野生型對照小鼠感染癥狀則非常明顯。并且,tim-3-tg小鼠外周血的抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細胞因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠。該結(jié)果進一步證明,增加tim-3表達能夠增強宿主抗立克次體免疫應(yīng)答。黑龍江立克次體感染重組人tim-3-人igg1-fc融合蛋白(htim-3-ig)預處理的人血管內(nèi)皮細胞(ea.hy926),結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染3天后該細胞內(nèi)立克次體數(shù)量顯著多于對照組細胞。這一結(jié)果說明,tim-3信號激活后能夠誘導血管內(nèi)皮細胞殺傷胞內(nèi)立克次體。用黑龍江立克次體感染穩(wěn)定高表達或低表達tim-3的ea.hy926細胞,立克次體感染3天后的結(jié)果顯示,tim-3高表達細胞的立克次體數(shù)量顯著低于對照細胞,而tim-3低表達細胞的立克次體數(shù)量顯著高于對照細胞。綜上所述,增加tim-3表達能夠增強血管內(nèi)皮細胞殺傷胞內(nèi)立克次體的作用,而阻斷tim-3信號或者抑制tim-3表達會抑制相關(guān)細胞因子和趨化因子的表達進而促進胞內(nèi)立克次體的增加。Tim-3在立克次體感染的過程中具有增強機體的抗感染免疫反應(yīng)。NO在殺傷胞內(nèi)菌方面發(fā)揮重要作用。我們用細胞因子(RANTES、TNF-α、IFN-γ和IL-1β)雞尾酒方法刺激人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),并用黑龍江立克次體感染該細胞。實驗結(jié)果顯示,細胞因子雞尾酒處理的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的NO顯著增加,同時胞內(nèi)立克次體拷貝數(shù)減少,而受iNOS抑制劑NGMMLA作用的內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)生減少,且細胞內(nèi)的立克次體數(shù)量增加。該研究明確證明,血管內(nèi)皮細胞能夠通過增加NO的合成去殺傷胞內(nèi)立克次體。Tim-3能否通過增強血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的NO抑制立克次體感染?我們的實驗結(jié)果顯示,無論是阻斷Tim-3信號通路還是降低Tim-3表達的血管內(nèi)皮細胞,感染立克次體后,細胞iNOS mRNA表達水平明顯降低,并且IFN-γmRNA表達水平也同樣降低。這些數(shù)據(jù)提示,Tim-3信號通路的激活能夠增強血管內(nèi)皮細胞的iNOS表達,并通過增加NO的合成去殺傷細胞內(nèi)的立克次體。我們還發(fā)現(xiàn),Tim-3-Tg小鼠感染3天后,脾臟細胞iNOS、IFN-γ和TNF-α的mRNA表達水平顯著高于野生型小鼠,而脾臟立克次體數(shù)量則顯著低于野生小鼠。這些數(shù)據(jù)進一步說明,Tim-3信號通路的激活能夠增強血管內(nèi)皮細胞的NO合成,從而增強機體抑制立克次體感染。本課題證明,在黑龍江立克次體感染早期,Tim-3表達增強和Tim-3信號通路的激活,能夠上調(diào)機體和血管內(nèi)皮細胞對立克次體的殺傷作用,并明確了NO是血管內(nèi)皮細胞殺傷胞內(nèi)寄生立克次體的重要因素。本研究豐富了立克次體致病機制和抗立克次體免疫機制內(nèi)容,為立克次體病的診治提供了新的潛在靶標。
【圖文】：

圖 1-1. pRNAi-U6.1/Neo 質(zhì) 圖譜細胞瞬時轉(zhuǎn)染24小時后，若細胞狀態(tài)良好，則向細胞培養(yǎng)基中加入G418的篩選濃度為500 ng/ml。每3天給細胞換一次新的培養(yǎng)基（含500 ng/ml G418）。

并將其與pEGFP-N1/NeoR/KanR（圖譜見圖1-2.）連接，酶切位alⅠ，獲得重組Tim-3的質(zhì)粒。. 轉(zhuǎn)染細胞系 步 驟 同 3.3 ，， 構(gòu) 建 成 穩(wěn) 定 高 表 達 Tim-3 的 EA.hy 926 細verexpression）；空載體轉(zhuǎn)染細胞株（Vector）為同型對照。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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