發(fā)布時間：2019-08-12 07:29

【摘要】：流感病毒分為甲、乙、丙三種型別,其中甲型流感病毒(IAV)作為引起流感大流行的主要型別,是威脅人類健康最主要的病原體之一。IAV在各年齡段人群中具有高傳染性,尤其在老人、兒童和免疫缺陷患者中更易傳播。據(jù)記載,1918年、1957年和1968年的流感大流行奪走了近5000萬人的生命。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球每年有5%~15%的人口感染流感,其中嚴(yán)重病例300萬~500萬人,25萬~50萬人死于其導(dǎo)致的并發(fā)癥。流感病毒的防治方法包括藥物治療和疫苗預(yù)防,其中藥物治療主要應(yīng)用神經(jīng)氨酸酶抑制劑和離子通道阻滯劑,但隨著抗病毒藥物的廣泛使用甚至濫用,導(dǎo)致了耐藥性毒株的出現(xiàn),嚴(yán)重影響了抗流感病毒藥物的治療效果。流感疫苗由于具有預(yù)防性、保護(hù)性及較低副作用而成為預(yù)防流感流行的研究熱點(diǎn)。目前,市售的流感病毒疫苗主要包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗,每種疫苗均含有甲型H1亞型、H3亞型和乙型三種流感病毒或抗原組份。由于以上三價疫苗所含病毒亞型覆蓋面較廣、生產(chǎn)工藝較為完善,因此成為現(xiàn)階段主流的抗流感病毒疫苗。然而,流感病毒具有較高的抗原突變性,疫苗毒種的選擇成為疫苗開研發(fā)的主要問題。目前季節(jié)性三價流感疫苗毒種的選擇是根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)基于前一季節(jié)的病毒循環(huán)抗原預(yù)測獲得,然而這種預(yù)測很難覆蓋流感病毒的抗原轉(zhuǎn)變。因此,研究者亟需研發(fā)一種廣譜、持久的通用型流感疫苗。近年來,隨著H1N1、H3N2、H5N1和H7N9等流感疫情的逐年遞增,廣譜流感疫苗的研發(fā)對于增強(qiáng)我國流感的預(yù)防控制能力尤為重要。研究表明,基于流感病毒的保守性蛋白(如基質(zhì)蛋白和表面蛋白等)研發(fā)的候選疫苗,可以在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體,這為廣譜流感疫苗的研發(fā)提供了新的空間。由于甲型流感病毒的紅細(xì)胞凝集素(HA)蛋白是主要的誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原位點(diǎn),同時HA頸部序列保守性較強(qiáng),所以基于流感病毒表面HA蛋白的候選疫苗的研發(fā)尤為集中。然而,基于高保守性HA蛋白的候選疫苗仍然存在缺點(diǎn)。首先,大多數(shù)廣譜中和抗體的誘導(dǎo)依賴空間、非連續(xù)性表位,為疫苗的生產(chǎn)、純化增加了難度。其次,一些中和抗體的中和機(jī)理尚不明確,不利于廣譜流感疫苗的深入研發(fā)。同時,由于高保守性蛋白亞單位疫苗及表位疫苗免疫原性較低,如何提高候選疫苗的免疫原性也成為了不可忽視的問題。因此,廣譜流感疫苗成功的關(guān)鍵是要同時具備高免疫原性和廣譜保護(hù)性。鑒于現(xiàn)階段已經(jīng)明確的流感病毒HA頸部功能區(qū)靶位抗體跨序列錨定HA1及HA2抑制變構(gòu)的中和機(jī)理,本研究的目的是設(shè)計一種新型的表位多肽免疫原,此免疫原需包含簡短的、線性優(yōu)勢表位,并具有較強(qiáng)免疫原性、中和活性及明確的中和機(jī)理。然后,經(jīng)過免疫原優(yōu)化設(shè)計,進(jìn)一步增加其免疫原性、廣譜中和活性及保護(hù)性。本論文主要分為以下兩個部分:第一部分:H3亞型IAV HA頸部保守區(qū)的多肽免疫原設(shè)計及中和機(jī)理的研究由于流感病毒序列的高突變性及免疫保護(hù)過程中的病毒結(jié)構(gòu)易變性,現(xiàn)階段可獲得的經(jīng)典流感病毒疫苗很難誘導(dǎo)或增強(qiáng)廣譜中和抗體的產(chǎn)生。而解決此問題的有效方法之一是了解廣譜中和抗體的中和機(jī)理,從而找到流感病毒與宿主膜融合過程中的中和位點(diǎn)。自1968年流感大流行起,H3N2流感病毒就一直持續(xù)導(dǎo)致人類極高的患病率及病死率,所以本部分實(shí)驗(yàn)首先針對1968年至2014年間10,763株H3N2流感病毒序列進(jìn)行序列分析、B細(xì)胞及MHC-II類分子T細(xì)胞表位預(yù)測,從中獲得了高度保守(保守率:97.59%±0.62%)的HA頸部片段及六條衍生多肽免疫原序列(P1~P6)。通過免疫原性檢測,我們確定了P6多肽序列中含有潛在的B細(xì)胞及MHC-II類分子T細(xì)胞表位,并且基于P6多肽序列的MAP4及以KLH為載體的免疫原都能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)(抗體效價:log104.14~4.74)和H3亞型內(nèi)交叉毒株中和活性(ID50:564.57~1408,P0.005)。經(jīng)過對已知的H3亞型IAV的HA晶體結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)P6多肽序列位于病毒膜融合過程中HA2的變構(gòu)拐點(diǎn)處,進(jìn)一步通過酸旁路實(shí)驗(yàn)及膜融合動力學(xué)試驗(yàn),我們提出并驗(yàn)證了P6多肽免疫原所誘導(dǎo)的中和抗體的中和機(jī)理:錨定HA2變構(gòu)拐點(diǎn),通過空間位阻抑制膜融合過程中HA2的變構(gòu)從而抑制膜融合。此段高保守性HA2頸部表位的設(shè)計及中和機(jī)理的確定能夠?yàn)槲磥砹鞲幸呙绲脑O(shè)計應(yīng)用及流感病毒臨床免疫治療提供參考。第二部分:三價流感表位嵌合No V P particle免疫原設(shè)計及誘導(dǎo)廣譜中和抗體的研究流感病毒HA2頸部功能區(qū)具有亞型內(nèi)高度的保守性及中和抗體的靶向性,具備成為廣譜流感病毒候選疫苗的潛力�；谇捌诮⒌膶�(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及提出的中和機(jī)理,我們通過序列分析及B細(xì)胞表位預(yù)測分別篩選出H1亞型和B型HA2頸部高保守功能表位(H1保守率:97±0.123%,B型保守率:99.98±0.003%),聯(lián)合已知的H3亞型P6表位,共同表達(dá)于No V P particle的三個環(huán)區(qū)上,制備出三價嵌合重組蛋白免疫原(Trivalent HA2-PP)。通過動物免疫、不同亞型病毒微中和檢測、體外保護(hù)性檢測,Trivalent HA2-PP誘導(dǎo)產(chǎn)生了針對各亞型HA2表位顯著的體液免疫反應(yīng)(log104.39~5.15),并且可以通過病毒交叉免疫加強(qiáng)特異性抗體效價,同時誘導(dǎo)的抗體在體外針對H3、B亞型流感病毒具有較強(qiáng)中和活性(ID50:45~656,P0.05)。同時,Trivalent HA2-PP的免疫在小鼠A/Texas/JMM_30/2012(H3N2)攻毒試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的H3亞型體內(nèi)保護(hù)性。本研究證明以HA2為基礎(chǔ)的三價嵌合No V P particle免疫原的設(shè)計能夠?yàn)榱鞲胁《緩V譜候選疫苗的研發(fā)提供理論與實(shí)驗(yàn)參考。綜上所述,本研究成功的設(shè)計、制備和評價了流感病毒HA2頸部保守區(qū)表位多肽免疫原,此種免疫原具有較高的免疫原性,所誘導(dǎo)中和抗體具有較強(qiáng)體外保護(hù)性。同時提出并驗(yàn)證了所誘導(dǎo)中和抗體的中和機(jī)理,即錨定HA2變構(gòu)拐點(diǎn),并以空間位阻抑制膜融合。此外,我們將免疫原篩選方法及抑制機(jī)理推廣至多亞型流感病毒并應(yīng)用于No V P particle載體表達(dá)系統(tǒng),成功的制備和評價了新型流感病毒三價重組蛋白疫苗。此疫苗具有更高的免疫原性及較好的體外、體內(nèi)保護(hù)性。因此,本論文中所設(shè)計的IAV HA2頸部功能區(qū)多肽免疫原及其重組蛋白免疫原均具有成為新一代的廣譜流感候選疫苗的潛力。
【圖文】：

段 RNA 鏈）編碼 10 種不同的蛋白質(zhì)，如圖 1.merase）蛋白（PB2、PB1 和 PA）、1 種核蛋白蛋白 HA 和 NA、2 種基質(zhì)蛋白（Matrix protein及 2 種非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-structral protein 1，NS[3]。

大流行的病毒傳播模式、疾病嚴(yán)重程度及死亡情l烈燦瀉艽蟮牟鉅�。�，

本文編號：2525565