發(fā)布時間：2019-07-19 18:12

【摘要】：目的采用PCR方法從剛地弓形蟲RH株基因組DNA中擴增弓形蟲ROP18基因,構(gòu)建原核表達載體pET-ROP18,并檢測融合蛋白ROP18的免疫反應(yīng)原性。方法采用PCR技術(shù)擴增弓形蟲ROP18基因,將其插入原核表達載體pET-28a中,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-ROP18,PCR和雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-ROP18轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21中,在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)下表達融合蛋白,誘導(dǎo)產(chǎn)物裂解后進行SDS-PAGE電泳,觀察重組蛋白的誘導(dǎo)表達情況,Western blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果以弓形蟲基因組DNA為模板,PCR擴增出約1.6kb的ROP18基因片段。將其定向插入原核表達載體pET-28a,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-ROP18,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后測序,顯示重組質(zhì)粒包含ROP18蛋白基因讀碼框內(nèi)的完整序列,能完整表達ROP18抗原蛋白。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達分子質(zhì)量單位約63ku的融合蛋白,以37℃1mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h表達量最大。Western blot分析重組蛋白能被鼠抗弓形蟲血清識別。結(jié)論成功構(gòu)建了原核表達載pET-ROP18,重組蛋白ROP18具有免疫反應(yīng)原性。
【圖文】：

表達載體的構(gòu)建與鑒定用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶分別雙酶切ＰＣＲ產(chǎn)物和ｐＣＤＮＡ３．１質(zhì)粒，分別回收目的基因ＲＯＰ１８小片段和載體ｐＣＤＮＡ３．１大片段，加入Ｔ４ＤＮＡ連接酶連接，轉(zhuǎn)入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ感受態(tài)細胞，用卡那霉素篩選陽性克攏鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ雙酶切，獲得約５．４ｋｂ和１．６ｋｂ兩條帶，大小與載體片段和目的ＤＮＡ長度相符；用引物進行ＰＣＲ擴增（擴增條件同上），得到單一條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖２）。測序結(jié)果進一步表明重組子含有ＲＯＰ１８基因。ＭＤＮＡ分子質(zhì)量標準１ｐＥＴ－ＲＯＰ１８ＰＣＲ產(chǎn)物２ｐＥＴ－ＲＯＰ１８用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ雙酶切圖２重組質(zhì)粒ｐＣＤＮＡ－ＲＯＰ１８的ＰＣＲ和酶切鑒定ＭＤＮＡｍａｋｅｒ１ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１８２ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１８ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢＦｉｇ．２ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ５ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ·５２８·中國病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１３年６月第８卷第６期Ｊｕｎｅ２０１３，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．６

ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｋｅｒ１ＢＬ２１ｗｉｔｈｏｕｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ２ｐＥＴ－２８ａｗｉｔｈｏｕｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ３ｐＥＴ－２８ａｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ４ｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｗｉｔｈｏｕｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ５ｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧＦｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ４重組蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)至ＮＣ膜上后，，進行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，顯示該蛋白可被鼠抗弓形蟲陽性血清識別（圖４）。表明該蛋白具有免疫反應(yīng)原性。Ｍ蛋白標志物１重組陽性質(zhì)粒ｐＥＴ－ＲＯＰ１８裂解物與鼠抗弓形蟲血清反應(yīng)條帶２空載體ｐＥＴ－２８ａ裂解物對照圖４表達產(chǎn)物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｋｅｒ１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｒｅｃｏｇ－ｎｉｚｅｄｂｙａｎｔｉｓｅｒａｆｒｏｍｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙａｎｔｉｓｅｒａｆｒｏｍｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄＦｉｇ．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ討論目前在弓形蟲病的免疫研究方面，大都致力于尋找和開發(fā)能有效刺激宿主產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答和抵御弓形蟲感染的免疫原。與其他單細胞生物一樣，弓形蟲含有多種具有免疫原性的分泌抗原，而這些代謝分泌抗原可誘導(dǎo)弓形蟲特異性Ｔ細胞增殖，刺激Ｔ細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并促進ＩＦＮ－γ的分泌，提高小鼠抗弓形蟲攻擊感染的保護性。弓形蟲體分泌抗原主要由蟲體
【作者單位】： 海南醫(yī)學(xué)院 海南省熱帶病重點實驗室;
【基金】：海南省自然科學(xué)基金項目(No.809018)
【分類號】：R382.5

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本文編號：2516419