【摘要】：目的采用PCR方法從剛地弓形蟲(chóng)RH株基因組DNA中擴(kuò)增弓形蟲(chóng)ROP18基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-ROP18,并檢測(cè)融合蛋白R(shí)OP18的免疫反應(yīng)原性。方法采用PCR技術(shù)擴(kuò)增弓形蟲(chóng)ROP18基因,將其插入原核表達(dá)載體pET-28a中,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-ROP18,PCR和雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-ROP18轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21中,在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白,誘導(dǎo)產(chǎn)物裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,觀察重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況,Western blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果以弓形蟲(chóng)基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增出約1.6kb的ROP18基因片段。將其定向插入原核表達(dá)載體pET-28a,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-ROP18,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后測(cè)序,顯示重組質(zhì)粒包含ROP18蛋白基因讀碼框內(nèi)的完整序列,能完整表達(dá)ROP18抗原蛋白。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)分子質(zhì)量單位約63ku的融合蛋白,以37℃1mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h表達(dá)量最大。Western blot分析重組蛋白能被鼠抗弓形蟲(chóng)血清識(shí)別。結(jié)論成功構(gòu)建了原核表達(dá)載pET-ROP18,重組蛋白R(shí)OP18具有免疫反應(yīng)原性。
【圖文】：

表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶分別雙酶切ＰＣＲ產(chǎn)物和ｐＣＤＮＡ３．１質(zhì)粒，分別回收目的基因ＲＯＰ１８小片段和載體ｐＣＤＮＡ３．１大片段，加入Ｔ４ＤＮＡ連接酶連接，轉(zhuǎn)入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ感受態(tài)細(xì)胞，用卡那霉素篩選陽(yáng)性克攏鑒定為陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ雙酶切，獲得約５．４ｋｂ和１．６ｋｂ兩條帶，大小與載體片段和目的ＤＮＡ長(zhǎng)度相符；用引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增（擴(kuò)增條件同上），得到單一條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖２）。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明重組子含有ＲＯＰ１８基因。ＭＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１ｐＥＴ－ＲＯＰ１８ＰＣＲ產(chǎn)物２ｐＥＴ－ＲＯＰ１８用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ雙酶切圖２重組質(zhì)粒ｐＣＤＮＡ－ＲＯＰ１８的ＰＣＲ和酶切鑒定ＭＤＮＡｍａｋｅｒ１ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１８２ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１８ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢＦｉｇ．２ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ５ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ·５２８·中國(guó)病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１３年６月第８卷第６期Ｊｕｎｅ２０１３，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．６

ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｋｅｒ１ＢＬ２１ｗｉｔｈｏｕｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ２ｐＥＴ－２８ａｗｉｔｈｏｕｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ３ｐＥＴ－２８ａｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ４ｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｗｉｔｈｏｕｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ５ｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧＦｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ４重組蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)至ＮＣ膜上后，，進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，顯示該蛋白可被鼠抗弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清識(shí)別（圖４）。表明該蛋白具有免疫反應(yīng)原性。Ｍ蛋白標(biāo)志物１重組陽(yáng)性質(zhì)粒ｐＥＴ－ＲＯＰ１８裂解物與鼠抗弓形蟲(chóng)血清反應(yīng)條帶２空載體ｐＥＴ－２８ａ裂解物對(duì)照?qǐng)D４表達(dá)產(chǎn)物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｋｅｒ１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｒｅｃｏｇ－ｎｉｚｅｄｂｙａｎｔｉｓｅｒａｆｒｏｍｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＥＴ－ＲＯＰ１８ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙａｎｔｉｓｅｒａｆｒｏｍｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄＦｉｇ．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ討論目前在弓形蟲(chóng)病的免疫研究方面，大都致力于尋找和開(kāi)發(fā)能有效刺激宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答和抵御弓形蟲(chóng)感染的免疫原。與其他單細(xì)胞生物一樣，弓形蟲(chóng)含有多種具有免疫原性的分泌抗原，而這些代謝分泌抗原可誘導(dǎo)弓形蟲(chóng)特異性Ｔ細(xì)胞增殖，刺激Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并促進(jìn)ＩＦＮ－γ的分泌，提高小鼠抗弓形蟲(chóng)攻擊感染的保護(hù)性。弓形蟲(chóng)體分泌抗原主要由蟲(chóng)體
【作者單位】： 海南醫(yī)學(xué)院 海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.809018)
【分類(lèi)號(hào)】：R382.5

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本文編號(hào)：2516419