【摘要】：背景和目的胚胎肝祖細胞可分化為成熟的肝細胞和膽管細。在胎肝發(fā)育中,分布在門靜脈周圍的肝祖細胞分化為膽管細胞,而分布肝實質(zhì)中遠離門靜脈的肝祖細胞則分化為肝細胞。本研究探索TGFβ信號通路在膽管發(fā)育中的作用,及其可能的調(diào)控機制。方法第一部分:將分離得到的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)培養(yǎng)至第二代,分成4組,分別用普通培養(yǎng)液、5ng/m L TGFβ1、5ng/m L TGFβ1+10μM TGFβR1抑制劑(SB525334)及10μM TGFβR1抑制劑(SB525334)處理72h。用熒光激活細胞篩選法(FACS)分選DLK1表面抗原陽性的小鼠胚胎肝細胞,并和肌成纖維細胞或成纖維細胞Transwell共培養(yǎng)或者單獨培養(yǎng)。細胞免疫熒光檢測MEFs處理72h后α㧟SMA的表達,檢測剛分選和共培養(yǎng)4、6d的DLK1+細胞的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)及細胞角蛋白19(CK19)抗原的表達。q RT-PCR檢測肌成纖維細胞和成纖維細胞α㧟SMA、HGF、TGFβ1、Jagged1、PTN、MDK、IGF1及IGF2等基因的表達,檢測胎肝祖細胞共培養(yǎng)6d后,CK19、ALB、AFP、Sox9等基因表達。第二部分:孕10.5的C57孕鼠共8只,隨機平均分成2組,藥物干預(yù)組腹腔注射TGFβRI抑制劑SB525334(5mg/kg)(溶于2.2%DMSO和97.8%玉米油),對照組腹腔注射等量的2.2%DMSO和97.8%玉米油為對照組,每天注射藥物,共干預(yù)8天。免疫熒光檢測E14.5、E16.5、E18.5、P0、P10等各個階段胎肝或肝臟的α㧟SMA、Sox9或CK19的表達,免疫熒光檢測藥物干預(yù)組和對照組E18.5胎肝α㧟SMA、Jagged1、Sox9、CK19的表達。q RT-PCR檢測藥物干預(yù)組和對照組E18.5胎肝α㧟SMA、Jagged1、Sox9、CK19基因的表達。免疫熒光試驗計數(shù)周圍區(qū)域門脈周圍Ck19+細胞的數(shù)量,計數(shù)在中央?yún)^(qū)域門脈周圍膽管的數(shù)量。然后計算每個動物中央?yún)^(qū)域的膽管數(shù)量/門靜脈的比值和周圍區(qū)域的膽管細胞數(shù)量/門靜脈的比值。結(jié)果第一部分:FACS分析示DLK1+細胞占E14.5胚胎肝細胞比例約10%~20%。體外共培養(yǎng)24 h內(nèi)分選的大部分DLK1+細胞開始分裂增殖,呈半貼壁生長。培養(yǎng)第2~3 d,細胞增殖明顯呈葡萄狀聚集生長,形態(tài)開始變成大圓形。共培養(yǎng)第4~6 d,部分細胞開始貼壁生長,并且形態(tài)成開始變梭形。細胞免疫熒光結(jié)果顯示,FACS分選的DLK1+細胞表達AFP和少量ALB,但是不表達CK19。在共培養(yǎng)的第4天其開始表達CK19,和微弱表達ALB;第6天,其高表達CK19,而幾乎不表達的ALB。以上結(jié)果說明分選DLK1+細胞大部分為m HPCs,與MEF共培養(yǎng)后可促進m HPCs增殖分化為膽管細胞。免疫熒光結(jié)果顯示MEFs能被TGFβ通路激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示和肌成纖維細胞共培養(yǎng)6天后,m HPCs大部分細胞貼壁增殖,并形成樹枝樣膽管結(jié)構(gòu)。而和成纖維細胞共培養(yǎng)組的m HPCs部分細胞貼壁增殖,部分細胞為圓形散在或成球增殖,未見樹枝樣膽管結(jié)構(gòu)。免疫熒光結(jié)果顯示肌成纖維細胞共培養(yǎng)組m HPCs的CK19的表達高于成纖維細胞組,而ALB的表達低于成纖維細胞組。q RT-PCR結(jié)果顯示肌成纖維細胞共培養(yǎng)組m HPCs的CK19、Sox9基因的表達高于成纖維細胞組,而AFP、KI67基因的表達低于成纖維細胞組(P0.05)。細胞計數(shù)結(jié)果表明肌成纖維細胞共培養(yǎng)組的m HPCs子代細胞數(shù)量是成纖維細胞共培養(yǎng)組約2.5倍(P0.05)。以上結(jié)果說明同成纖維細胞相比,肌成纖維細胞促進胎肝祖細胞向膽管細胞分化作用更強,但抑制其增殖。第二部分:免疫熒光證實在E14.5~E18.5階段,α-SMA+肌成纖維細胞主要分布在門靜脈周圍,出生后包繞膽管。此外,肌成纖維細胞為門靜脈周圍表達Jagged1的主要細胞,在膽管發(fā)育中起重要作用。阻斷TGFβ信號通路后,中央?yún)^(qū)域的膽管數(shù)量/門靜脈的比值和周圍區(qū)域的膽管細胞數(shù)量/門靜脈的比值明顯減少(P0.05),說明TGFβ信號通路在膽管發(fā)育中發(fā)揮重要作用。當阻斷TGFβ信號通路后,免疫熒光證實門靜脈周圍間質(zhì)細胞α-SMA的表達減少,q RT-PCR檢測進一步證實α-SMA基因的轉(zhuǎn)錄降低(P0.05),說明TGFβ信號通路調(diào)控門靜脈周圍間質(zhì)細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。同時免疫熒光證實門靜脈周圍Jagged1的表達也相應(yīng)減少,q RT-PCR檢測進一步證實Jagged1基因的轉(zhuǎn)錄降低(P0.05),說明TGFβ信號通路調(diào)控門靜脈周圍的間質(zhì)細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化進而調(diào)控Jagged1表達。但膽管細胞Jagged1的表達未見減少,說明膽管細胞Jagged1的表達不受TGFβ信號通路的調(diào)控。在膽管發(fā)育中,Sox9為Notch通路的下游,阻斷TGFβ信號通路后,門靜脈周圍Sox9+膽管細胞明顯減少,q RT-PCR檢測進一步證實Sox9基因的轉(zhuǎn)錄降低(P0.05),說明TGFβ信號通路可能通過Jagged1-Notch-Sox9機制途徑調(diào)控膽管的發(fā)育。結(jié)論1.應(yīng)用FACS技術(shù)成功從E14.5胎肝細胞中分選出DLK1+細胞并鑒定其大部分為m HPCs,在體外與MEFs Transwell共培養(yǎng)的條件下可擴增培養(yǎng)并誘導(dǎo)其分化為膽管細胞。2.在Transwell共培養(yǎng)的條件下,與成纖維細胞相比,肌成纖維細胞促進m HPCs向膽管細胞分化作用更強,但促進其增殖的能力較低。3.在動物體內(nèi),TGFβ信號通路在肝內(nèi)膽管的發(fā)育中起重要作用,可能通過Jagged1-Notch-Sox9機制途徑調(diào)控膽管的發(fā)育。
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圖片說明： 重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 FACS 分選的 DLK1 陽性細胞得率及鑒定本實驗中, 采用酶消化法平均每個 E14.5 胎肝可得到有核細胞總數(shù)約（2~3）×106。 用 FACS 分選技術(shù)將 E14.5 胎肝中 DLK1 陽性細胞分選出來, 7-AAD 排除死亡細胞, DLK1+細胞占胚胎肝細胞比率為 10 %~20 %（圖 1.1）。
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圖片說明： 22圖 1.2 FACS 分選 DLK1 陽性細胞初步鑒定Fig1.2 Identification of DLK1+cells by immunocytochemical method（A~D×400; E~F×100）注：A. DAPI； B. AFP； C. ALB； D Merge； E. DAPI ； F. CK19； G Merge3.2 體外共培養(yǎng)的 mHPCs 的生長特性倒置顯微鏡觀察顯示新分選出來的細胞大小均一, 呈小圓形, 核質(zhì)比高（圖1.3A）。培養(yǎng) 24 h 后, 大部分細胞開始分裂增殖（圖 1.3B）, 培養(yǎng)第 2~3 天細胞增殖明顯, 細胞體積變大, 呈松弛的葡萄狀（圖 1.3C）。形態(tài)及增殖特性方面顯示, 分選出來的細胞即為 mHPCs。但繼續(xù)培養(yǎng)到第 4~6 天, 部分細胞開始貼壁, 形態(tài)開
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R321

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本文編號：2514660