【摘要】：由于甲型流感病毒變異快、抗甲流病毒的化學藥物毒副作用大,易產(chǎn)生耐藥性,同時有效疫苗的制備難度很大,因此尋找一種安全、簡便、高效的甲型流感防治藥物成為目前具有挑戰(zhàn)性的研究課題。卵黃抗體(Egg yolk immunoglobulin, IgY)具有來源廣、特異性好、安全無殘留、性能穩(wěn)定及價格合理等優(yōu)點,在病毒性疾病的預防、治療和診斷方面具有廣闊的應用前景。本課題采用滅活甲型流感病毒為抗原免疫產(chǎn)蛋雞,制備特異性IgY,對IgY的體內(nèi)外抗病毒活性及其在甲型流感病毒檢測中的應用進行研究,為特異性IgY在甲型流感的預防、治療及檢測方面的應用提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容分為四部分：1抗甲型流感病毒卵黃抗體的制備1.1以滅活甲型H1N1流感病毒A/廣東/732/2009(H1N1)pdm09和A/加利福尼亞州/7/2009(H1N1)pdm09毒株及季節(jié)性甲型流感病毒A/廣東/622/2009(H1 N1)和A/廣東/749/2009(H3N2)毒株為抗原分別免疫蛋雞獲得特異性IgY。采用PEG沉淀法得到IgY純度95.80%,回收率93.01%。1.2經(jīng)ELISA檢測,不同抗原免疫產(chǎn)生的抗體效價隨時間的變化趨勢基本一致,1 mg/mL的IgY的最高效價達3200,最高效價在卵黃中可持續(xù)6周,高效價抗體(2500)在卵黃中可持續(xù)10周以上。2抗甲型H1N1流感病毒卵黃抗體的體外活性評價主要對抗甲型H1N1流感病毒A／廣東/732/09(H1N1)pdm09 IgY的抗病毒活性進行了分子水平和細胞水平上的評價。2.1瓊脂擴散和熒光免疫實驗,結(jié)果表明IgY能與病毒顆粒結(jié)合并使其產(chǎn)生沉淀；Western Blot分析和HI實驗,結(jié)果顯示IgY能與病毒表面的主要膜蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)及基質(zhì)蛋白(M)發(fā)生特異性結(jié)合,能有效抑制病毒對紅細胞的凝集作用,1.0mg/mL的IgY能完全抑制紅細胞凝集的最高稀釋倍數(shù)為128。2.2空斑減數(shù)試驗,結(jié)果說明IgY能有效中和病毒,直接抑制病毒對宿主細胞的吸附,IC50 2.0 μg/mL;能有效阻止病毒吸附于細胞；能抑制細胞內(nèi)病毒的復制增殖；體外抗病毒作用明顯、穩(wěn)定。3抗甲型H1N1流感病毒卵黃抗體的小鼠體內(nèi)抗病毒活性研究3.1 IgY對A/廣東/732/2009(H1N1)pdm09感染小鼠的死亡保護作用將BALB/C小鼠隨機分為15組,正常組,模型組,磷酸奧司他韋治療組,抗A/廣東/732/09 (H1N1)pdm09 IgY預防組(含大、中、小劑量3組)、治療組(含大、中、小劑量3組)和預防-治療組(含大、中、小劑量3組),陰性IgY中劑量預防組、治療組和預防-治療組。以5LD50的流感病毒液每只50.0gL滴鼻感染小鼠造模,正常組以生理鹽水滴鼻對照。預防組在感染前2h給藥1次；治療組自感染后2h開始給藥,每天1次,持續(xù)給藥4天；預防-治療組感染前2h給藥1次,其他給藥同治療組。自造模當日起連續(xù)觀察2周,計算各組存活率及體重保持率。結(jié)果顯示：①模型組和陰性IgY各組的存活率都為10%。特異性IgY各組存活率≥90%,與模型相比較有極顯著性差異,P0.001。②模型組和陰性IgY各組的小鼠體重均先下降,后緩慢上升,顯著低于正常組。特異性IgY各組體重明顯高于模型組。特異性IgY中劑量治療組的體重變化和存活率與磷酸奧司他韋治療組無差異。3.2 IgY對A／廣東/732/09 (H1N1)pdm09感染小鼠肺損傷及病毒增殖的影響將BALB/C小鼠隨機分為6組,正常組,模型組,磷酸奧司他韋治療組,抗A/廣東/732/09 (H1N1)pdm09 IgY中劑量預防組、治療組和預防-治療組。分別在感染后第3天和第6天隨機處死小鼠,摘取肺臟。計算肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率,應用RT-PCR測定感染小鼠肺組織病毒載量,HA實驗測定感染小鼠肺組織病毒滴度,HE染色光鏡觀察感染小鼠肺部組織的病理學變化。結(jié)果顯示：①各個時間點,模型組與IgY各組的肺指數(shù)均有上升趨勢,但IgY各組肺指數(shù)明顯低于模型組。感染后第3天,IgY各組與模型組相比有顯著性差異,P0.05；感染后第6天,IgY各組與模型組相比較有極顯著性差異,P0.01。②各個時間點,模型組小鼠肺組織病毒載量和病毒滴度都明顯高于IgY各組。IgY預防-治療組與模型組相比較,具有極顯著差異,P0.001；其他各組與模型組相比較,均具有極顯著性差異,P0.01。③在病理組織切片中,IgY各組的肺組織結(jié)構(gòu)基本完整,壞死與浸潤級別低。4甲型H1N1流感病毒表面增強拉曼光譜免疫分析方法的建立與應用以檸檬酸三鈉為還原劑成功制備金溶膠；用4,4'-聯(lián)吡啶作為拉曼標記分子對金溶膠進行標記制備標記金溶膠；用IgY與標記金溶膠結(jié)合制備標記免疫金溶膠；標記免疫金溶膠與標記金溶膠的SERS圖譜相一致。采用硅烷化、醛基化的方法在凹形載玻片上進行IgY的組裝,制備固相抗體。優(yōu)化實驗步驟,建立表面增強拉曼光譜標記免疫分析檢測甲型H1N1流感病毒的方法,對甲型H1N1流感病毒進行檢測,病毒滴度在0.2 TCID50到2000 TCID50范圍內(nèi),4,4'-聯(lián)吡啶的SERS信號和抗原濃度呈線性關(guān)系,線性方程是Y=2348.4 X-1525.8,相關(guān)系數(shù)為0.9998。
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圖片說明： 第一章緒論逡逑結(jié)構(gòu)，共Ｈ層，從外到內(nèi)一次為雙層囊膜、基質(zhì)蛋白和核殼體口，－２９１。Ａ型流感逡逑病毒顆粒的結(jié)構(gòu)和組成如圖１－１ＩＷ。逡逑在最外層的囊膜上分布著ＨＡ和ＮＡ兩種糖蛋白，ＨＡ、ＮＡ根植于宿主逡逑來源的脂質(zhì)雙層膜中，因突出在病毒的外表面而稱為刺突。蛋白Ｍ２稱為離逡逑子通道，貫穿病毒的雙層囊膜。逡逑：邋■邋！逡逑ＩＰＢ１逡逑？詩逡逑圖１－１甲型流感病毒顆粒的結(jié)構(gòu)和組成逡逑Ｆｉｇ．ｌ－ｌ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｕｓ邋ｐ；＂邋ｔｋｌｅ逡逑（引自邋Ｍａｒｋ邋ｖｏｎ邋Ｉｔｚｓ化ｉｎ邋等專著：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ｖｉｉ邋ｕｓＳｉａｌＵｌａｓｅ邋－邋Ａ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ逡逑Ｔａｒｇｅｔ，邋２０１１）逡逑中間層為球形蛋白殼，由基質(zhì)蛋白Ｍｌ形成，位于脂質(zhì)雙層膜下面，與逡逑病毒囊膜內(nèi)壁緊密接合，，共同構(gòu)成流感病毒的外殼骨架，對保護病毒核屯、和逡逑維持病毒空間結(jié)構(gòu)起著重要作用。逡逑５逡逑
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 在ＨＡ的結(jié)構(gòu)研究中，研究最透徹的是胞外區(qū)的結(jié)構(gòu)。在１９８１、１９９４和逡逑１９９８ｆ＂－４＂年分別測定了融合前的構(gòu)象、榞合后的構(gòu)象和未切割前體所對應的逡逑晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示如圖１－２所示［＂１，ＨＡ１亞單位用呁色表示，ＨＡ２亞單位逡逑用紅色表示，ＨＡ１的３２３位殘基到ＨＡ２的１２位殘基用綠色表示，病毒囊膜逡逑位于底部，球狀頭部位于頂部，ＨＡ１和ＨＡ２之間的切割位點存在與靠近一逡逑個深腔的環(huán)中。逡逑８逡逑
【學位授予單位】：廣東工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392;O657.37

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本文編號：2514138